August/2 August 2009

Now Japanese only

Competent　cellの作り方

 * あらかじめ菌を培養しておく.
 * Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える.
 * 37度で一晩おく.
 * 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約２時間Incubate.
 * 分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate.
 * OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
 * 遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注. はかりで測って重さを均一にする.
 * 8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離. （ローターのサイズにも注意,20 を使う）
 * 上澄みをデカンテーション.
 * 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える.
 * On ice 10min冷蔵室に放置
 * 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離.
 * 上澄みをデカンテーション.
 * 0.1M CaCl2（冷やしておく）をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える.
 * on ice 30min冷蔵室に放置.
 * 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離.
 * 上澄みをデカンテーション. （注意深く）
 * ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50％　グリセロール（すべて冷やされているもの）を加えてvortex.
 * -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注. 再び-80℃で保管.
 * 以上です.

Transformationの方法

 * ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
 * エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように. （DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く. ）
 * コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える.
 * 30min On ice
 * 2min,42℃でHeat shock
 * 5min on ice
 * LBを900μl入れる.
 * 37℃で22min　Incubate
 * platingを行う. プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる.
 * プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate.
 * 以上です. 不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ. 文責　中村　匡

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