Team:Paris/Fiche g3p

 Fiche Thématique G3P

 Introduction En cours de rédaction et de traduction... [...]g3p est une protéine virale [...]domaines de la G3P [...]fonction que l'on veux utiliser Afin d'etre sur que la g3p soit bien localiser à la surface de la membrane externe, nous avons décidé de fusionner la g3p (délété de son peptide signal) à une biobrique (BBa_K103006), crée par l'équipe de Varsovie 2008, qui contient un complexe OmpA-Linker La biobrique BBa_K103006 n'etant pas compatible avec le standard que nous avons choisis, nous avons désigner des oligo ajoutant les sufixes et prefixes standard. Afin de pouvoir garder le systeme de fusion initial grace à SacI, un site SacI à été rajouté en N-ter de la G3P suivant le schéma suivant: Prefixe-OmpA-Linker-SacI-Suffixe et Prefixe-SacI-(&Delta;18aa)G3P-Suffixe. Ces deux biobrick peuvent etre inserer dans un vecteur standard. Le produit de ligation apres digestion par SacI est le suivant Prefixe-OmpA-Linker-SacI-(&Delta;18aa)G3P-Suffixe, qui est lui même une biobrick, ce qui va nous permetre de l'incorporer à la construction finale.

 DH5&alpha; G3P [BB_G3P]
 * ON culture (+Amp) for Glycerol Stock
 * ON culture (+Amp) for MiniPrep
 * Miniprep
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * PCR (Matrice = Miniprep) (Ctrl+ et Ctrl -)
 * Purification amplicon
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Digestion of amplicon by (BB Enzyme)
 * Digestion of vecteur by (Which one)(BB Enzyme)
 * Ligation
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Sequencage (Oligo)
 * ON culture for Glycerol Stock and Petri disches (Medium)
 * Submit on Parts Registry

 BBa_K103006 OmpA-Linker [BB_OmpA_L]
 * Resuspention (How)
 * Transformation (DH5&alpha;?)
 * ON culture for Glycerol Stock and Petri disches (Medium)
 * ON culture for MiniPrep (Medium)
 * Miniprep
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * PCR (Matrice = Miniprep) (Ctrl+ et Ctrl -)
 * Purification amplicon
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Digestion of amplicon by (BB Enzyme)
 * Digestion of vecteur by (Which one)(BB Enzyme)
 * Ligation
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Sequencage (Oligo)
 * ON culture for Glycerol Stock and Petri disches (Medium)
 * Submit on Parts Registry

 OmpA-Linker-G3P
 * Digestion of [BB_OmpA_L] by SacI and (BB Enzyme)
 * Digestion of [BB_G3P] by SacI and (BB Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Purification of digestion productss
 * Ligation
 * Digestion by (Enzyme)
 * Gel for digestion product (Fragment Weight)
 * Sequencage??? (Oligo)
 * ON culture for Glycerol Stock and Petri disches (Medium)
 * Submit on Parts Registry

 Expression of OmpA-Linker-G3P at the bacterial surface Cf: [Warsaw08] 1. Pouring bacteria by drops onto nitrocellulose. 2. Drying. 3. Blocking. 4. Anti-A antibody binding. 5. Washing. 6. Anti-rabbit antibody binding. 7. Developing with BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) and NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride) Together they yield an intense, insoluble black-purple precipitate when reacted with Alkaline Phosphatase.BCIP is hydrolyzed by alkaline phosphatase to form an intermediate that undergoes dimerization to produce an indigo dye

 Titre BlaBla