Team:Chiba/Project

The Project

1. Introduction
2. Project Design
3. Experiments, Results & Discussion
   1. Making LuxR Mutants
   2. Characterization
   3. For improving pictures
   4. Demonstration
4. Conclusion

Introduction

(手術予定)

• 細胞通信を使ったBacterial Timer を創ります。
• E. coli Timer完成予想図（画像作成中です--Yoshimi 09:12, 20 October 2009 (UTC)）
• Timerを創る方法は様々（diffusion of molecules, switching（oscillator, communication, arabinose, plac, etc... ））であるが、なぜ細胞通信を選んだのか。

そして、昨年は2段階の通信しか創れなかった。バリエーションが乏しい。

• 作戦変更!（Sender側をかえたCrosstalk通信にはバリエーションを創るのに限界があるので、今年はReceiver側の調節をする。）目指すは時計の数字分の、１２通りの時間差をつくりたい！

It has been demanded in biological engineering that making the function that organisms sense the passage of time. We can utilize the excellent functions of organisms such as material synthesis or sensing as a device for drug delivery system or physical exam when these functions have been time-controlled as we like. However we can control cells individually, without method to control them all together, advantage of excellent functions may attenuate. Then we want to make the timer that cells works concurrently.

Project Design

For making some timers without need of synchronizer system and that can be used in a single system we try to make following design.

（手術予定）

2) Project Design

⑤Receiver側のAHL通信の仕組みを図説する。（1,AHLが入るところ（培地調節）　2,Receiver中のLuxR 3,Receiver中のReporter）

Signaling System

• sender使わないからいらないのでは？というか，cell-cell comunicationは使ってなくてただのtranscription activatorとしてluxRを使っているだけ...という面がつよい...ので，luxRの転写活性化がどのようにおこるか，をメインにしてはいかが?--Maiko 13:43, 20 October 2009 (UTC)
• 次項のスクリーニングでsenderを使うので、ここでも図にSenderを入れておくべきだと考えます。--Yoshimi 14:10, 20 October 2009 (UTC)

なんじゃこりゃーなおします。--Yoshimi 13:22, 20 October 2009 (UTC) In this project, we use acylated homoserine lactones (AHLs), signaling molecules used for [http://en.wikipedia.org/wiki/Quorum_sensing quorum sensing] in gram negative bacteria. Senders express LuxI or similar enzymes, which catalyze the production of AHLs, under the control of a constitutive (Tet) promoter. Each cell thus generates AHL more or less at a constant rate. AHL can freely permeate cell membranes and are detected by neighboring cells. Receivers constitutively express LuxR proteins (or a similar ortholog), the protein that detects AHL concentrations. When AHLs bind LuxR proteins, the AHL-LuxR complex activates the Lux promoter. The threshold [AHL] at which switching occurs is determined by the affinity of AHL for the particulr LuxR ortholog. about quorum sensing)

Experiments, Results & Discussion

LuxR mutantづくり

• directed evolutionで色々な応答速度のLuxR mutantをつくることを目指した。

Experiments

Fig. Y Directed evolution to get some delayed-LuxR mutants

• error-prone PCRでLuxRの変異ライブラリを作製し，発現ベクターに組み込んだ
• これを，E.coli BW(?) harboring plux-gfpに形質転換し，コロニーを形成させた。
• コロニーをニトロセルロース膜でリフトし，AHL入りのプレートにのせ，gfpの蛍光の経時変化をみた（Fig. X)。
• 蛍光しはじめるのが遅いものを13個pickし，delayed-LuxR変異体を得た。
• pickした13個のクローンの転写活性化速度?を，再度transformして確認し，最終的に○個の速度バリエーションのluxR変異体を得た。

Fig. X LuxRライブラリ？によるのPlux-gfp蛍光経時変化

• （こんな感じでよいでしょか？絵はとりあえずポスタのやつを画面キャプチャしてベタばり --Maiko 13:09, 20 October 2009 (UTC)）

（手術予定） ⑥Mutantを創る。（Error-proneが良い理由：バリエーションを創りやすい。新たなBiobrick作成方法としてError-prone PCRとスクリーニングをセットにしMutant-Partsの作り方を説明する。）

⑦さらに詳しい実験方法（Biobrickからerror-prone PCRをおこなったことなど）

⑧得られたデーター（なぜ8000のライブラリを、200に絞り、どうやって13sampleを選び出したのか説明）

得られたLuxR mutantのcharacterization

⑨LuxR Mutant 個性確定実験の実験方法

⑩100 nM培地での応答の遅れについての結果

⑪ＡＨＬ濃度を振った場合の、６ｈ後の蛍光強度の差についての結果

⑫LuxR Mutantの個性と、変位が入っている部分からの考察

より良い絵を描くために/To draw more better picture

• we screened the "agar media condition" (the thickness & the agar conc.) to make difference in the delay of the LuxR mutant more bigger(appearent?).
• ちょっと思ったのだがこのAHL濃度とか培地とかふりまくってるのを載せると，LuxRの時間差が見えた理由が「LuxR変異体のおかげ」というよりは「培地のおかげ」っぽくなるので，この培地スクリーニングは実は載せない（というかちっちゃくのせとくのは良いけどVIP待遇はしない）方がまだ恰好がつくのでは...^w^;--Maiko 14:05, 20 October 2009 (UTC)

• ⑬培地を振った実験について。実験方法と結果。

培地のよりよい条件を見つける

私たちはデモをよりはっきり見せるために必要な培地の条件を調べた。

まず、次の４種類の培地を作成した。

1)agar 1% and 薄い(約1.5 mm)

2)agar 5% and 厚い(約7 mm)

3)agar 1% and 薄い(約1.5 mm)

4)agar 5% and 厚い(約7 mm)

この４種類の培地上にNitro Cellulose filterをのせ、その上でそれぞれ13種のMutantsを3 coloniesずつ培養した。

培養後、Nitro Cellulose filterごとそれぞれの培地をカッターで切り出して同じ厚さの2000 nMのAHLを含む培地にのせて目視で蛍光の観察を始めた。

この実験をした結果、各mutant LuxRが光りだす時刻の差は、(4)のagar 5% and 厚い 培地で最も大きい差が見られた。

つまり厚さが薄かったりagar が少なかったりした培地上でのmutant LuxRが光りだす時刻のばらつき具合よりも、この(4)の培地上でのばらつき具合の方がはっきりしていた。

だから私たちはこの培地条件を使ってdemoをすることにした。

• ⑭Reporter毎の応答の差についての実験と結果。ＧＦＰuvがＤｅｌａｙを見やすい。

私たちは、ReporterとしてGFPuv, sfGFP, mRFP, mCherry, mOrangeを使って上に挙げたものと同じ実験をした。

• ⑮Reporter毎の応答についての考察。

Demonstration

⑯E. coli Timer完成デモ

（⑰できればアニメ）

Conclusions

手術予定

18・Biobrickを使って（iGEM的には）新たな方法（error-prone PCR）を用い、新パーツをつくりました。

・何通り（ただいま確認中）のバリエーションの遅れを生み出せました。（Mutant+WT:4~5種、gel調節：2種、Reporters: 4通り・・・これらの組み合わせの分（タイミングがかぶるのは除く）だけ時間差をうみだせた！）

・demonstrationをおこないました。

⑲ Future Works : Whisper down the lane