Team:Chiba/Project

Introduction

Implementing a "Timer" Function!

Project Design

（手術予定）

2) Project Design

⑤Receiver側のAHL通信の仕組みを図説する。（1,AHLが入るところ（培地調節）　2,Receiver中のLuxR 3,Receiver中のReporter）

Team:Chiba/Project/Signaling-system

Experiments, Results & Discussion

LuxR mutantづくり

• directed evolutionで色々な応答速度のLuxR mutantをつくることを目指した。

Experiments

• 下の絵すこし汚いですね：jpgじゃない？pngとかgifで保存すればもっと絵が綺麗になるはず

Fig. Y Directed evolution to get some delayed-LuxR mutants

• error-prone PCRでLuxRの変異ライブラリを作製し，発現ベクターに組み込んだ
• これを，E.coli BW(?) harboring plux-gfpに形質転換し，コロニーを形成させた。
• コロニーをニトロセルロース膜でリフトし，AHL入りのプレートにのせ，gfpの蛍光の経時変化をみた（Fig. X)。
• 蛍光しはじめるのが遅いものを13個pickし，delayed-LuxR変異体を得た。
• pickした13個のクローンの転写活性化速度?を，再度transformして確認し，最終的に○個の速度バリエーションのluxR変異体を得た。

Fig. X LuxRライブラリ？によるのPlux-gfp蛍光経時変化

• genotypeをのせよう

（手術予定） ⑥Mutantを創る。（Error-proneが良い理由：バリエーションを創りやすい。新たなBiobrick作成方法としてError-prone PCRとスクリーニングをセットにしMutant-Partsの作り方を説明する。）

⑦さらに詳しい実験方法（Biobrickからerror-prone PCRをおこなったことなど）

⑧得られたデーター（なぜ8000のライブラリを、200に絞り、どうやって13sampleを選び出したのか説明）

得られたLuxR mutantのcharacterization

⑨LuxR Mutant 個性確定実験の実験方法

Experimental Method

⑩100 nM培地での応答の遅れについての結果

⑪ＡＨＬ濃度を振った場合の、６ｈ後の蛍光強度の差についての結果

⑫LuxR Mutantの個性と、変位が入っている部分からの考察

Demonstration

⑯E. coli Timer完成デモ 明日のよるにはあげられます。--Yoshimi 14:21, 20 October 2009 (UTC)

（⑰できればアニメ）

For the determination of best condition for E coli painting, Click here!

Conclusions

• By using error-prone PCR, we have created a LuxR library.
• With a simple and convenient screening method, we have isolated various LuxR mutants which confer delayed switching behavior in GFP signals.
• By introducing these LuxR variants together with reporter genes (such as GFP) under the control of Lux promoter, we created bacteria 'ink's that develop their color with unique delay-time.
• We conducted painting with these bacteria inks thereby created animated pictures.
• Characterization of LuxR mutants is ongoing. But our preliminary data showed that some of the variants turned out to be the one with less sensitivity to AHLs, and others seemed to be as sensitive as wild-type LuxR but seemed less efficient somewhere in the downstream process.
• We created variety of Biobricks during the course of this projects. Some of them are characterized and sent to the HQ, and many more are almost ready for shipping!