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August/2 August 2009
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Revision as of 09:12, 30 August 2009
Competent cellの作り方
- あらかじめ菌を培養しておく。
- Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
- 37度で一晩おく。
- 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約２時間Incubate。
- 分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
- OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
- 遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注。はかりで測って重さを均一にする。
- 8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離。（ローターのサイズにも注意,20 を使う）
- 上澄みをデカンテーション。
- 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
- On ice 10min冷蔵室に放置
- 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
- 上澄みをデカンテーション。
- 0.1M CaCl2（冷やしておく）をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
- on ice 30min冷蔵室に放置。
- 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
- 上澄みをデカンテーション。（注意深く）
- ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50％ グリセロール（すべて冷やされているもの）を加えてvortex。
- -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。
- 以上です。
Transformationの方法
- ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
- エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。（DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。）
- コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
- 30min On ice
- 2min,42℃でHeat shock
- 5min on ice
- LBを900μl入れる。
- 37℃で22min Incubate
- platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
- プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。
- 以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責 中村 匡
