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Introduction
Making a "bacterial timer"!
- our project is to make 複数種類の"bacterial timer".
- our approach to this goal is to make a series of a transcription factor which each of them differes in a responce time of the transcription activation by an same inducer.
- we believe that this device would be useful for making an macroscopic timing control in bacterial behavior or many application in synthetic biology & iGEM community.
- to demonstrate this "timing control", we aimed to draw an "animated picture": a picture that pop up one by one.
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- ほんとに今のイントロでよいですか？わかりやすさだけを追求して書いたので深みはそんなにないです。質問や付け足したいことあれば言ってください--Maiko 23:45, 20 October 2009 (UTC)
- タイトルでsince2008とうたっている以上、手術予定にあるように昨年度のこともつけたすべきたと考えます。--Yoshimi 03:17, 21 October 2009 (UTC)
- あら？じゃあ全部採用しなくて良いのですが...^^;いつの間にか全採用ぽくなっていたので少し吃驚しました。あくまでも案です。でも解りやすいはずだとは思うので使うとこあれば使ってください。--Maiko 06:14, 21 October 2009 (UTC)
(手術予定)
- 細胞通信を使ったBacterial Timer を創ります。
- E. coli Timer完成予想図
- Timerを創る方法は様々（diffusion of molecules, switching（oscillator, communication, arabinose, plac, etc... ））であるが、なぜ細胞通信を選んだのか。
そして、昨年は2段階の通信しか創れなかった。バリエーションが乏しい。
- 作戦変更!（Sender側をかえたCrosstalk通信にはバリエーションを創るのに限界があるので、今年はReceiver側の調節をする。）目指すは時計の数字分の、１２通りの時間差をつくりたい！
Project Design
（手術予定）
2) Project Design
⑤Receiver側のAHL通信の仕組みを図説する。（1,AHLが入るところ（培地調節） 2,Receiver中のLuxR 3,Receiver中のReporter）
Team:Chiba/Project/Signaling-system
Experiments, Results & Discussion
- directed evolutionで色々な応答速度のLuxR mutantをつくることを目指した。
Experiments
- 下の絵すこし汚いですね：jpgじゃない？pngとかgifで保存すればもっと絵が綺麗になるはず
 Fig. Y Directed evolution to get some delayed-LuxR mutants - error-prone PCRでLuxRの変異ライブラリを作製し，発現ベクターに組み込んだ
- これを，E.coli BW(?) harboring plux-gfpに形質転換し，コロニーを形成させた。
- コロニーをニトロセルロース膜でリフトし，AHL入りのプレートにのせ，gfpの蛍光の経時変化をみた（Fig. X)。
- 蛍光しはじめるのが遅いものを13個pickし，delayed-LuxR変異体を得た。
- pickした13個のクローンの転写活性化速度?を，再度transformして確認し，最終的に○個の速度バリエーションのluxR変異体を得た。
 Fig. X LuxRライブラリ？によるのPlux-gfp蛍光経時変化
（手術予定）
⑥Mutantを創る。（Error-proneが良い理由：バリエーションを創りやすい。新たなBiobrick作成方法としてError-prone PCRとスクリーニングをセットにしMutant-Partsの作り方を説明する。）
⑦さらに詳しい実験方法（Biobrickからerror-prone PCRをおこなったことなど）
⑧得られたデーター（なぜ8000のライブラリを、200に絞り、どうやって13sampleを選び出したのか説明）
得られたLuxR mutantのcharacterization
⑨LuxR Mutant 個性確定実験の実験方法
Experimental Method
⑩100 nM培地での応答の遅れについての結果
⑪ＡＨＬ濃度を振った場合の、６ｈ後の蛍光強度の差についての結果
⑫LuxR Mutantの個性と、変位が入っている部分からの考察
Demonstration
⑯E. coli Timer完成デモ
明日のよるにはあげられます。--Yoshimi 14:21, 20 October 2009 (UTC)
（⑰できればアニメ）
For the determination of best condition for E coli painting, Click here!
Conclusions
手術予定
18・Biobrickを使って（iGEM的には）新たな方法（error-prone PCR）を用い、新パーツをつくりました。
- error-proneを用いて新パーツを作ったことではなく，そのスクリーニング法（AHL濃度が徐々に大きくなっていくとき，遅れて光る変異体をpick）が新しいと主張していたのではないでしょうか。--Masahiro 15:24, 20 October 2009 (UTC)
- まあどっちも些末ですが......................！（ep-PCRはランダム化のひとつの手法です＆スクリーニング法は「新しい」と主張するのは変；そしたら何をやっても新しくなっちゃう；「工夫した」「ウリです」的なノリなら良いとおもうのだが）という理由で，書かない方が良い気がするんだけどなあ，でも私の頭もだいぶ真面目すぎるところがあるかもしれないので先生達とも要相談でいきましょう。--Maiko 23:40, 20 October 2009 (UTC)
- あ，てか「最後のまとめ」として書くにはだいぶインパクトにかけるなあと思ったのですが，そうではなくて，「達成した事」として箇条書き的に色々書くうちの１つであるならば（毎年「〜個のパーツ化に成功」とか書くノリ）別に良いんじゃないかなと思います，ごめんそーいうことだったのでしょうか？でしたら私の勘違いです。書くと良いとおもいます。--Maiko 23:40, 20 October 2009 (UTC)
・何通り（ただいま確認中）のバリエーションの遅れを生み出せました。（Mutant+WT:4~5種、gel調節：2種、Reporters: 4通り・・・これらの組み合わせの分（タイミングがかぶるのは除く）だけ時間差をうみだせた！）
- LuxR以外の時間差は出さない方が良いです：転写だとかフォールディングだとかマチュレーションで時間差でるなら何故luxR変異体つくったのだという話になる：transcription activatorで差が出せたことをいうべし（ていうかそれが目的なのであり，何でもかんでも時間差が出したいというわけじゃない，よね，たしか）--Maiko 14:47, 20 October 2009 (UTC)
- 何でもかんでも時間差が出したい，という結論だったと思います（先日の梅ミーティングでは）。--Masahiro 15:30, 20 October 2009 (UTC)
- それはデモでいい絵をみせるため...結論としちゃいかんでしょう--Maiko 23:40, 20 October 2009 (UTC)
・demonstrationをおこないました。
⑲ Future Works : Whisper down the lane
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時計というものに、時間だけでなく順番も入れられる。
例えば培地中に拡散するＡＨＬにムラがあったとしても、ちゃんと順番通りに動くシステム、
バリエーションは作れないが順番ならば得意。
成長するアニメーションを作るには、この順番通りに動くシステムが必要。
アニメを作るときは時間の刻み方が人にとって意味を持つようなものであることが大切。
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