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From 2009.igem.org

2009/08/02

Competent　cellの作り方

1. あらかじめ菌を培養しておく。
2. Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
3. 37度で一晩おく。
4. 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約２時間Incubate。
5. 分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
6. OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
7. 遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注。はかりで測って重さを均一にする。
8. 8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離。（ローターのサイズにも注意,20 を使う）
9. 上澄みをデカンテーション。
10. 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
11. On ice 10min冷蔵室に放置
12. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
13. 上澄みをデカンテーション。
14. 0.1M CaCl2（冷やしておく）をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
15. on ice 30min冷蔵室に放置。
16. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
17. 上澄みをデカンテーション。（注意深く）
18. ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50％　グリセロール（すべて冷やされているもの）を加えてvortex。
19. -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。

以上です。

Transformationの方法

1. ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
2. エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。（DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。）
3. コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
4. 30min On ice
5. 2min,42℃でHeat shock
6. 5min on ice
7. LBを900μl入れる。
8. 37℃で22min　Incubate
9. platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
10. プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。

　　　　　以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責　中村　匡

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