Team:Osaka/Meeting

From Notebook

2009/08/02

Preparing CaCl₂competent cell

preparation

Pick a single colony (strain

1. Nova Blue) and inoculate 5 ml LB
2. Incubate overnight at 37°C
3. Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer
4. Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD₆₀₀=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min)
5. When the culture reaches an OD₆₀₀ between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile)
6. On ice for 10min
7. Centrifuge:8krpm,5min,4°C
8. Discard supernatant
9. Resuspend each pellet in 20 ml chilled 0.1 M MgCl₂ and add further 15 ml 0.1 M MgCl (total 45 ml)
10. On ice for 10min
11. Centrifuge:8krpm,5min,4℃
12. Discard supernatant
13. Resuspend each pellet in 20 ml chilled 0.1 M CaCl₂ and add further 15 ml 0.1 M MgCl (total 45 ml)
14. On ice 30min
15. Centrifuge:8krpm,5min,4℃
16. Discard supernatant carefuly
17. Resuspend each pellet in 750 µl pre-chilled 0.1 M CaCl₂ and 750 µl pre-chilled 50%(v/v) Glycerol
18. Aliquot 500~100 ul of the mix into sterile microfuge tubes that are pre-chiled at -80℃
19. stock at -80℃

Transformationの方法

1. ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
2. エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。（DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。）
3. コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
4. 30min On ice
5. 2min,42℃でHeat shock
6. 5min on ice
7. LBを900μl入れる。
8. 37℃で22min　Incubate
9. platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
10. プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。

以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責　中村　匡