Team:Groningen/Notebook/5 August 2009
From 2009.igem.org
(Difference between revisions)
m (→GVP Cluster) |
(→Metal Accumulation) |
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Line 40: | Line 40: | ||
===Metal Accumulation=== | ===Metal Accumulation=== | ||
+ | : '''Restriction''' | ||
+ | {| | ||
+ | |10 ul | ||
+ | |GlpF PCR | ||
+ | |- | ||
+ | |1.5 ul | ||
+ | |Fast DigestBuffer | ||
+ | |- | ||
+ | |0.5 ul | ||
+ | |XbaI | ||
+ | |- | ||
+ | |0.5 ul | ||
+ | |PstI | ||
+ | |- | ||
+ | | | ||
+ | {| | ||
+ | |10 ul | ||
+ | |ArsRMBP fusie (ligatie overnight 04-08-09) | ||
+ | |- | ||
+ | |1.5 ul | ||
+ | |Fast DigestBuffer | ||
+ | |- | ||
+ | |0.5 ul | ||
+ | |XbaI | ||
+ | |- | ||
+ | |0.5 ul | ||
+ | |PstI | ||
+ | |- | ||
+ | | | ||
+ | {| | ||
+ | |11 ul | ||
+ | |psB1AC3 (30/07/09 nienke) | ||
+ | |- | ||
+ | |5 ul | ||
+ | |Fast DigestBuffer | ||
+ | |- | ||
+ | |2.5 ul | ||
+ | |XbaI | ||
+ | |- | ||
+ | |2.5 ul | ||
+ | |PstI | ||
+ | |- | ||
+ | |} | ||
+ | | | ||
+ | |} | ||
+ | |||
+ | :*37 30min | ||
+ | :* Inactivation on Gel | ||
+ | :* Extraction from gel | ||
+ | |||
+ | |||
+ | :'''Ligation''' | ||
+ | {| | ||
+ | |2 uL | ||
+ | |Ligase buffer | ||
+ | | | ||
+ | |rowspan="4" style="border-left:solid 1px"|16° 1h → 65° 10 min | ||
+ | |- | ||
+ | |1 ul | ||
+ | |T4 Ligase | ||
+ | | | ||
+ | |- | ||
+ | |11 uL | ||
+ | |GlpF digested with EcoRI and SpeI | ||
+ | |rowspan="2" style="border-left:solid 1px"|42° 2 min → | ||
+ | |- | ||
+ | |11 uL | ||
+ | |psB1AC3 digested with EcoRi and SpeI | ||
+ | |- | ||
+ | |} | ||
+ | |||
+ | :'''Tranformation''' | ||
+ | ::* add 4 uL of the GlpFpsB1AC3 ligation mixture to 50uL competent e.coli top10 cells. | ||
+ | Incubate: | ||
+ | :::*30 min @ ice | ||
+ | :::*5 min 37° | ||
+ | :::*5min @ ice | ||
+ | ::*add 800uL LB | ||
+ | :::* incubate for 1 h at 37° | ||
+ | ::* plate on LB-AMP plates | ||
==Dry== | ==Dry== | ||
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Revision as of 13:08, 5 August 2009
It's my birthday!!! (Michael)
So cake it is....
Wet
GVP Cluster
- → DONE buy a nice cake and eat it ;)
- → TODO isolate plasmids from overnight precultures
- → DONE perform a ligation between cut vector and GVP fragment
- → DONE transform E.coli TOP10 competent cells with ligation product
Ligation
- 2 uL Ligase buffer
- 1 ul T4 Ligase
- 8 uL plasmid pSB1AC3 digested with PstI and SpeI
- 4 uL insert GVP restricted with XbaI and PstI
Incubate:
- 25°C 30min.
- kept on ice for 10min.
Tranformation
- add 10uL of the pSB1AC3-GVP ligation product to 50uL competent E.coli TOP10 cells.
Incubate:
- 30 min @ ice
- 50 sec 42°C
- 2 min @ ice
- add 800uL LB-medium
- incubate for 1 h at 37°C
- plate on LB-amp50 plates
Transporters
GlpF Restriction, ligation and transformation as noted below.
Metal Accumulation
- Restriction
10 ul | GlpF PCR | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1.5 ul | Fast DigestBuffer | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
0.5 ul | XbaI | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
0.5 ul | PstI | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Incubate:
Dry
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