Team:Osaka/Meeting
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- | ;;;;;;# | + | ;;;;;;#Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer |
- | ;;;;;;# | + | ;;;;;;#Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD<sub>600</sub>=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min) |
- | + | ;;;;;;#When the culture reaches an OD<sub>600</sub> between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile) | |
- | ;;;;;;# | + | ;;;;;;#Keep cells on ice for 10min |
- | ;;;;;;# | + | ;;;;;;#Centrifuge:8krpm, 5min,4°C |
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;;;;;;#0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。 | ;;;;;;#0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。 | ||
;;;;;;#On ice 10min冷蔵室に放置 | ;;;;;;#On ice 10min冷蔵室に放置 |
Revision as of 05:40, 11 August 2009
From Notebook
2009/08/02
Preparing CaCl2competent cell
#preparation
- Pick a single colony (strain
- Nova Blue) and inoculate 5 ml LB
- Incubate overnight at 37°C
- Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer
- Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD600=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min)
- When the culture reaches an OD600 between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile)
- Keep cells on ice for 10min
- Centrifuge:8krpm, 5min,4°C
- Carefully discard supernatant
- 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
- On ice 10min冷蔵室に放置
- 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
- 上澄みをデカンテーション。
- 0.1M CaCl2(冷やしておく)をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
- on ice 30min冷蔵室に放置。
- 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
- 上澄みをデカンテーション。(注意深く)
- ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50% グリセロール(すべて冷やされているもの)を加えてvortex。
- -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。
- 以上です。
Transformationの方法
- ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
- エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。(DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。)
- コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
- 30min On ice
- 2min,42℃でHeat shock
- 5min on ice
- LBを900μl入れる。
- 37℃で22min Incubate
- platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
- プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。
- 以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責 中村 匡