Team:Osaka/Meeting

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====Preparing CaCl<sub>2</sub>competent cell ====
====Preparing CaCl<sub>2</sub>competent cell ====
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<b>pre cluture</b>
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<b>#preparation</b>
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;;;;;;#  
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;;;;;;#Pick a single colony (strain:Nova Blue) and inoculate 5 ml LB
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;;;;;;# Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
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;;;;;;#Incubate overnight at 37°C
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;;;;;;# 37度で一晩おく。
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;;;;;;#Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer
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;;;;;;# 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約2時間Incubate。
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;;;;;;#Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD<sub>600</sub>=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min)
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;;;;;;#分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
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;;;;;;#When the culture reaches an OD<sub>600</sub> between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile)
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;;;;;;#OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける)
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;;;;;;#Keep cells on ice for 10min
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;;;;;;#遠心分離管(J.20、サイズに注意、冷やしておく)にピペッターで20mlずつ4本分注。はかりで測って重さを均一にする。
+
;;;;;;#Centrifuge:8krpm, 5min,4°C
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;;;;;;#8krpm,4℃、roter ID 20、5min で遠心分離。(ローターのサイズにも注意,20 を使う)
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;;;;;;#Carefully discard supernatant
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;;;;;;#上澄みをデカンテーション。
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;;;;;;#0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
;;;;;;#0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
;;;;;;#On ice 10min冷蔵室に放置
;;;;;;#On ice 10min冷蔵室に放置

Revision as of 05:40, 11 August 2009

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2009/08/02

Preparing CaCl2competent cell

#preparation

Pick a single colony (strain
  1. Nova Blue) and inoculate 5 ml LB
  2. Incubate overnight at 37°C
  3. Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer
  4. Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD600=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min)
  5. When the culture reaches an OD600 between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile)
  6. Keep cells on ice for 10min
  7. Centrifuge:8krpm, 5min,4°C
  8. Carefully discard supernatant
  9. 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
  10. On ice 10min冷蔵室に放置
  11. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  12. 上澄みをデカンテーション。
  13. 0.1M CaCl2(冷やしておく)をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
  14. on ice 30min冷蔵室に放置。
  15. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  16. 上澄みをデカンテーション。(注意深く)
  17. ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50% グリセロール(すべて冷やされているもの)を加えてvortex。
  18. -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。
以上です。

Transformationの方法

  1. ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
  2. エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。(DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。)
  3. コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
  4. 30min On ice
  5. 2min,42℃でHeat shock
  6. 5min on ice
  7. LBを900μl入れる。
  8. 37℃で22min Incubate
  9. platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
  10. プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。
以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責 中村 匡