Team:Osaka/Meeting

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;;;;;;# あらかじめ菌を培養しておく。
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;;;;;;# Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
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;;;;;;# 37度で一晩おく。（over night→o/n)
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;;;;;;# 大量に菌が得られたら、40ml LBを入れた三角フラスコに菌にいれて37度で約２時間Incubate。
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;;;;;;# 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約２時間Incubate。
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;;;;;;#分光光度計でOD=0.3になるまでIncubate。
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;;;;;;#分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
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;;;;;;#三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
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;;;;;;#OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
;;;;;;#遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注。はかりで測って重さを均一にする。
;;;;;;#遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注。はかりで測って重さを均一にする。
;;;;;;#8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離。（ローターのサイズにも注意）
;;;;;;#8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離。（ローターのサイズにも注意）
;;;;;;#上澄みをデカンテーション。
;;;;;;#上澄みをデカンテーション。
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;;;;;;#0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてVortex,その後同じものをさらに10ml加える。
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;;;;;;#On ice 10min冷蔵室に放置
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;;;;;;#8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
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;;;;;;#上澄みをデカンテーション。（注意深く）
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以上です。

Revision as of 05:55, 3 August 2009

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2009/08/01

2009/08/02

Competent　cellの作り方

  1. あらかじめ菌を培養しておく。
  2. Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
  3. 37度で一晩おく。
  4. 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約２時間Incubate。
  5. 分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
  6. OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける）
  7. 遠心分離管（J.20、サイズに注意、冷やしておく）にピペッターで20mlずつ４本分注。はかりで測って重さを均一にする。
  8. 8krpm,4℃、roter ID 20、５min で遠心分離。（ローターのサイズにも注意）
  9. 上澄みをデカンテーション。
  10. 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
  11. On ice 10min冷蔵室に放置
  12. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  13. 上澄みをデカンテーション。
  14. 0.1M CaCl2（冷やしておく）をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
  15. on ice 30min冷蔵室に放置。
  16. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  17. 上澄みをデカンテーション。（注意深く）
  18. ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50％　グリセロール（すべて冷やされているもの）を加えてvortex。
  19. -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。

以上です。

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