Team:Osaka/Meeting

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2009/08/02

Preparing CaCl2competent cell

pre cluture

  1. Single colonyを試験管にとり、5mlのLBを加える。
  2. 37度で一晩おく。
  3. 大量に菌が得られたら、40mlのLBを入れた三角フラスコ2つに菌をいれて37度で約2時間Incubate。
  4. 分光光度計でOD60=0.3になるまでIncubate。
  5. OD60=0.3になったら、三角フラスコをOn ice 10min (常に道具は冷やした状態をこころがける)
  6. 遠心分離管(J.20、サイズに注意、冷やしておく)にピペッターで20mlずつ4本分注。はかりで測って重さを均一にする。
  7. 8krpm,4℃、roter ID 20、5min で遠心分離。(ローターのサイズにも注意,20 を使う)
  8. 上澄みをデカンテーション。
  9. 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす)をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
  10. On ice 10min冷蔵室に放置
  11. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  12. 上澄みをデカンテーション。
  13. 0.1M CaCl2(冷やしておく)をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
  14. on ice 30min冷蔵室に放置。
  15. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
  16. 上澄みをデカンテーション。(注意深く)
  17. ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50% グリセロール(すべて冷やされているもの)を加えてvortex。
  18. -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。
以上です。

Transformationの方法

  1. ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
  2. エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。(DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。)
  3. コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
  4. 30min On ice
  5. 2min,42℃でHeat shock
  6. 5min on ice
  7. LBを900μl入れる。
  8. 37℃で22min Incubate
  9. platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
  10. プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。
以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責 中村 匡