Team:Osaka/Meeting

From Notebook

2009/08/02

Preparing CaCl₂competent cell

#preparation

Pick a single colony (strain

1. Nova Blue) and inoculate 5 ml LB
2. Incubate overnight at 37°C
3. Inoculate 30 ml LB with 1ml of o/n preculture in sterile 100 ml erlenmeyer
4. Incubate culture at 37°C on a shaker up to OD₆₀₀=0.3~0.5 (Measure OD value first 1hr and each 30min)
5. When the culture reaches an OD₆₀₀ between 0.3 and 0.5, transfer the culture into 50 centrifugation tube(sterile)
6. Keep cells on ice for 10min
7. Centrifuge:8krpm, 5min,4°C
8. Carefully discard supernatant
9. 0.1M MgCl2溶液(これも使う直前に冷やす）をそれぞれ最初にピペッターで15ml加えてvortex,その後同じものをさらに10ml加える。
10. On ice 10min冷蔵室に放置
11. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
12. 上澄みをデカンテーション。
13. 0.1M CaCl2（冷やしておく）をピペッターで25ml加えてvortex、さらに10ml加える。
14. on ice 30min冷蔵室に放置。
15. 8krpm,4℃,roterID 20, 5minで遠心分離。
16. 上澄みをデカンテーション。（注意深く）
17. ピペットマンで750μl 0.1M CaCl2、750μl 50％　グリセロール（すべて冷やされているもの）を加えてvortex。
18. -80℃に冷やしたペンTubeに遠心分離管の内容物をピペットマンで50μlずつ分注。再び-80℃で保管。

以上です。

Transformationの方法

1. ウェルに15μl milliQ水をいれてピペッティング
2. エッペンTubeに回収、ナンバリングを忘れないように。（DNAプレートに書いてある数とアルファベット、その上にプレートナンバーを書く。）
3. コンピ100μlにつき、DNAを2μl加える。
4. 30min On ice
5. 2min,42℃でHeat shock
6. 5min on ice
7. LBを900μl入れる。
8. 37℃で22min　Incubate
9. platingを行う。プレートにエッペンTubeの内容物をあけ、autoclaveされたビーズをいれてふる。
10. プレートに日付、名前をかいて、37℃でIncubate。

以上です。不明な点はのりさん、とりっぴー、ただしまでどうぞ。文責　中村　匡