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| | + | ==Introduction== |
| | + | Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium studied for the properties of its cell cycle. (reference cycle cellulaire) This bacterium is widely spread in aquatic environments and exists either as a motile cell or as a sessile cell (Figure 1). In the sessile stage, C. crescentus sticks to surfaces by synthesizing adhesive at the stalk, a polar organelle shown in figure 2. At the tip of this appendage, a complex holdfast structure is assembled. |
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| + | PHOTO 1 |
| - | == Overall project ==
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| + | This material is an elastic, gel-like adhesive substance composed of both protein and polysaccharide. The N-acetylglucosamine polymer has been identified as the main polysaccharide component. (reference sucre) This holdfast shows unprecedented adhesive properties: a single C. crescentus cell can adhere with a strength up to 68 N/mm2. In comparison, commercial superglue can withstand a force of 18-30 N/mm2. (reference force colle) Since this adhesive adheres to wet surfaces, many industrial applications are foreseen. The glue has already been isolated but the challenge is to produce large amounts of glue without it sticking to the material where it is produced. |
| - | Réparer des fuites, des coques de bateaux, un os fracturé,... Tout autant d’applications nécessitant un matériau adhésif de qualité et adapté. Aujourd’hui, le monde de la colle est très vaste, qu’elle soit d’origine végétale, animale ou, de manière plus courante, synthétique. Nous proposons de produire un nouveau type de glue aux avantages attrayants. En effet, alors que de nombreuses super glues commerciales sont souvent toxiques, la colle que nous envisageons de produire est non seulement non toxique, mais également biodégradable, beaucoup plus puissante que les glues actuelles et opérationnelle en milieux humides. Mais d’où provient donc ce petit miracle ? Il s’agit d’un polysaccharide sécrété par <i>Caulobacter crescentus</i>, une bactérie gram négative, hydrophile, vivant dans de nombreux milieux aquatiques, non toxique pour l’être humain. De plus, produire de la colle au moyen de bactéries représente un avantage énergétique non négligeable par rapport aux synthèses industrielles habituelles. Notre objectif est d’utiliser le système des Biobricks afin de transformer la célèbre et bien connue Escherichia coli et lui permettre de produire cette colle. Par ailleurs nous nous proposons également d’utiliser une nouvelle technologie de stabilisation de plasmides ne nécessitant pas d’utiliser d’antibiotique et permettant une production de protéines plus efficace, le système StabyTM mis au point pas Delphi Genetics. Si nous parvenons à produire la « Glucoli », nous pourrons par la suite aller plus loin dans l’application en envisageant un targetting spécifique de la colle ou encore une synthèse régulée par quorum sensing à l’image des colles epoxy ou colles à deux composants.
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| - | === Current glues ===
| + | A model of holdfast biosynthesis, export and attachment in C. crescentus has already been characterised. (REFERENCE) |
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| - | === Advantages of our glue ===
| + | PHOTO 2 |
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| - | === Usecase ===
| + | The hfsE hfsF hfsG hfsH genes are organized in operon and their products are required for the minimum repeat unit holdfast synthesis while the polymerization of the repeat unit of the holdfast substance needs the expression of hfsC and hfsI genes. |
| | + | The products of the 3 adjacent hfsD hfsA and hfsB genes are involved in the holdfast export and the anchoring of the holdfast polysaccharide is carried out by the hfa gene products. (reference adhesion) |
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| - | === Perspectives ===
| + | As Escherichia coli possess 7 similar genes [1]involved in the production and the export of the holdfast in C. crescentus, we only inserted the hfsG and hfsH genes in an E. Coli strain. |
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| - | == Project details ==
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| - | === ''Caulobacter'''s holdfast system ===
| + | Our aim is to find a way of mass-producing the glue. For this purpose, we planned to transfer the C. crescentus holdfast polysaccharide biosynthesis pathway to Escherichia coli. We built a synthetic E. coli producing the glue: GluColi. |
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| - | <div style='color:grey;'>
| + | The problem of stickiness to the material of the container used to produce the glue was not investigated. In fact, we thought it was more relevant to synthesize the glue whenever and wherever it is required, instead of focusing on the extraction of the adhesive. For this purpose, we designed a theoretical circuit using chemotaxis and quorum sensing. The circuit will be presented in the “Biological model” section. |
| - | Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique, gram négative qui se divise asymétriquement en deux cellules filles structurellement et fonctionnellement différentes : une cellule pédonculée et une cellule mobile munie d’un flagelle. La cellule mobile se différencie ensuite en cellule pédonculée. C’est au bout du pédoncule qu’est sécrété un polysaccharide constitué d’oligomères de N-acétylglucosamine (GlcNAc).
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| - | Ce polysaccharide est synthétisé, exporté et attaché au bout du pédoncule grâce à une série d’enzymes membranaires. Nous distinguons les enzymes de synthèse HfsE (glycosyltransférase), HfsG (glycosyltransférase), HfsH (carbohydrate estérase) et HfsF, une flipase HfsF, une polymérase HfsC, les enzymes d’exportation HfsA, HfsB et HfsD et, enfin, les enzymes d’attachement HfaA, HfaB et HfaD. HfaA et HfaD sont localisées au niveau du pédoncule. Ce système permet à Caulobacter de s’attacher à n’importe quel substrat, même humide. Les gènes codant pour ces enzymes sont organisés en opéron. Ainsi, il y a l’opéron hfsABCD, l’opéron hfsEFGH et l’opéron hfaABD.
| + | GluColi started producing an adhesive material and we begun to characterize the glue in the “Physical and chemical properties of our glue” section. |
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| - | === Implementation in ''E. coli'' ===
| + | The “Mathematical design” will also discussed. |
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| - | Notre objectif est de transférer ce système chez E. coli. Cependant, nous n’aurons pas recours à toutes les protéines que l’on trouve chez Caulobacter. En effet, dans le but de pouvoir récupérer la colle, nous avons décidé de faire abstraction des enzymes d’attachement Hfa afin que le polysaccharide soit sécrété dans le milieu. D’autre part, il a été montré que des homologues de HfsE, HfsF, HfsC, HfsA, HfsB et HfsD existent chez E. coli. Après avoir réalisé les cartes de restriction de tous ces gènes qui nous ont révélé de très nombreux sites incompatibles avec les standards d’assemblage, nous avons donc décidé de n’introduire dans E. coli que les gènes dont elle ne possède pas d’homologue, à savoir hfsG et hfsH.
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| - | Notre objectif est de parvenir à diriger GluColi de sorte qu'elle détecte une fissure qu'elle aura à réparer. Pour cela, nous imaginons un système dans lequel GluColi serait attiré par chimiotactisme vers la fissure. Une certaine densité bactérienne atteinte, la production des enzymes lui permettant de produire la glue serait enclenchée. En même temps, pour éviter toute prolifération, la réplication serait empêchée ; GluColi ne serait donc plus qu'une "machine productrice de glue".
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| - | Nous pensons fonctionner avec un système en cascade. La première étape consiste à attirer GluColi vers la faille. Nous avons pensé que le matériau à réparer serait recouvert d'un vernis. Là où une fissure apparaîtrait, le matériau lierait spécifiquement une matrice constituée d'un mélange d'aspartate et d'IPTG. Cette technique reste encore à étudier, mais dans le principe, il s'agit que la fissure envoie un signal à GluColi. Dans une perspective plus ambitieuse, nous pourrions imaginer appliquer cette technique pour réparer de petites fractures osseuses en fonction des signaux moléculaires émis par celles-ci.
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| - | L'aspartate est un chémoattractant naturel de E. coli. (... à compléter avec un joli texte résumant la littérature, renvoi vers une autre page ...)
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| - | GluColi, attirée par l'aspartate entre en contact avec l'IPTG qui provoque la cascade d'évènements.
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| - | La présence d'IPTG active le promoteur LacI, induisant la production de cI 434 (un répresseur issu du phage 434, fréquemment utilisé pour la régulation de protéines).
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| - | <partinfo>K196008 DeepComponents </partinfo>
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| - | Le répresseur cI 434 ainsi produit inhibe à son tour la production du répresseur c2 issu du phage P22.
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| - | <partinfo>K196009 DeepComponents</partinfo>
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| - | P22 c2 n'étant plus produit, l'inhibition est alors levée pour les acteurs du quorum sensing qui entrent donc en scène. (... à compléter avec un joli texte résumant la littérature, renvoi vers une autre page ...) LuxI sytnhétise le 3OC6HSL. Ce dernier, de concert avec la protéine LuxR, active le promoteur contrôlant la transcription des gènes G et H ainsi que celui codant pour la Barnase. Ce promoteur a également été placé devant le promoteur inductible à l'IPTG pou assurer qu'un défaut d'IPTG n'entraîne pas une nouvelle répression du système. Il est également présent devant le générateur de LuxI afin d'en augmenter la synthèse. Le promoteur c2 P22 a également été placé devant notre "glue device" afin d'éviter toute production fortuite de colle car le promoteur inductible à HSL+LuxR peut avoir un certain bruit de fond (... à vérifier ...).
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| - | <partinfo>K196010 DeepComponents</partinfo>
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| - | <partinfo>K196013 DeepComponents</partinfo>
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| - | <partinfo>K196012 DeepComponents</partinfo>
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| - | === Staby system ===
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| - | Comme annoncé plus haut, nous proposons d’améliorer l’utilisation des outils fournis par l’iGEM en incorporant à notre projet la nouvelle technologie de stabilisation de plasmides StabyTM. Grâce à ce système, nous n’aurons pas besoin d’utiliser d’antibiotiques pour produire la colle, ce qui représente de nombreux avantages : en effet, les antibiotiques sont onéreux et ils sont susceptibles de contaminer la production. Cette contamination n’étant pas tolérable, il est nécessaire de prouver l’absence de contamination dans le produit final, processus également coûteux. Par ailleurs, il a été constaté que la synthèse de protéines est améliorée quand on utilise ce système. Comment cela fonctionne ? Staby met en oeuvre le système poison-antidote. Le poison est la protéine CcdB, un poison naturel agissant sur l’ADN gyrase de E. coli (protéine essentielle pour la réplication du chromosome bactérien). CcdA, par contre, est l’antidote à ce poison. Le gène codant pour CcdB a été placé sur le chromosome de E. coli, dans des souches fournies par Delphi Genetics. Quant au gène codant pour CcdA, celui-ci est introduit dans le plasmide qui va accueillir notre construction pour la production de la colle. De cette manière, le plasmide est stabilisé, la bactérie ne peut le perdre, auquel cas, elle mourra. Il n’est donc plus nécessaire d’utiliser d’antibiotique.
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| - | == Lab work ==
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| - | === Experiments ===
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| - | === Results ===
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Caulobacter crescentus is a gram-negative bacterium studied for the properties of its cell cycle. (reference cycle cellulaire) This bacterium is widely spread in aquatic environments and exists either as a motile cell or as a sessile cell (Figure 1). In the sessile stage, C. crescentus sticks to surfaces by synthesizing adhesive at the stalk, a polar organelle shown in figure 2. At the tip of this appendage, a complex holdfast structure is assembled.
This material is an elastic, gel-like adhesive substance composed of both protein and polysaccharide. The N-acetylglucosamine polymer has been identified as the main polysaccharide component. (reference sucre) This holdfast shows unprecedented adhesive properties: a single C. crescentus cell can adhere with a strength up to 68 N/mm2. In comparison, commercial superglue can withstand a force of 18-30 N/mm2. (reference force colle) Since this adhesive adheres to wet surfaces, many industrial applications are foreseen. The glue has already been isolated but the challenge is to produce large amounts of glue without it sticking to the material where it is produced.
A model of holdfast biosynthesis, export and attachment in C. crescentus has already been characterised. (REFERENCE)
The hfsE hfsF hfsG hfsH genes are organized in operon and their products are required for the minimum repeat unit holdfast synthesis while the polymerization of the repeat unit of the holdfast substance needs the expression of hfsC and hfsI genes.
The products of the 3 adjacent hfsD hfsA and hfsB genes are involved in the holdfast export and the anchoring of the holdfast polysaccharide is carried out by the hfa gene products. (reference adhesion)
As Escherichia coli possess 7 similar genes [1]involved in the production and the export of the holdfast in C. crescentus, we only inserted the hfsG and hfsH genes in an E. Coli strain.
The problem of stickiness to the material of the container used to produce the glue was not investigated. In fact, we thought it was more relevant to synthesize the glue whenever and wherever it is required, instead of focusing on the extraction of the adhesive. For this purpose, we designed a theoretical circuit using chemotaxis and quorum sensing. The circuit will be presented in the “Biological model” section.
GluColi started producing an adhesive material and we begun to characterize the glue in the “Physical and chemical properties of our glue” section.
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