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Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols
From 2009.igem.org
Protocol used to make our yeasts produce light
PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO
CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae
Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34. Material:
- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible oxígeno. Guardar a –20ºC.
Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
- Tubos para el luminómetro.
Procedimiento:
1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].
2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado para mantener la expresión del plásmido.
3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho volumen del cultivo.
4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Eliminar el sobrenadante.
6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).
7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en la oscuridad.
8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se desee).
9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.
11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.
En el caso de inducción por pH alcalino:
8. Añadir 173μL de medio
9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a 4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre diferentes cepas. b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).
10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal durante 15 segundos.
11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
Otros tipos de estrés:
NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).
KCl: 30μL KCl 100mM.
Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera para tener resultados reproducibles.
