Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols

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(→Protocol used to make our yeasts produce light)
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'''PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae'''
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'''PROTOCOL OF CITOPLASMATIC Ca2+ INCREASEMENT MEASUREMENT IN ''S. cerevisiae'''''
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Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.
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Modified from the original Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.
Material:
Material:
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- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al.
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- pEVP11[AEQ] plasmid: apoaequorina expression (Batiza et al.
(1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
(1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
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- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol
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- Coelenterazine solution: Diluted coelenterazine until 590μM in satured N2 metanol. This compound is extremely photosensible and it's inhibited by O2. Keep at –20ºC.
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saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible
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oxígeno. Guardar a –20ºC.
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Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
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Note: We bought Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
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SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir
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SIGMA. We put N2 gas into metanol during 5 minutes, and we added inmediately 200μL to the 50μg of coelenterazine.
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inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
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- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
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- Luminometer.
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- Tubos para el luminómetro.
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- Luminometer tubes and ELISA plaques.
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Procedimiento:
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Procedure:
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1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].
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1. We recieved pEVP11[AEQ] aequorin transformed yeast from Joaquin Arinyo.
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2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado
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2. We let growing up o/n in SD lacking Leu medium to maintain plasmid expression.  
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para mantener la expresión del plásmido.
+
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3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una
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3. After incubation, measure OD a 660nm y calculate the necessary volum to obtain in 250μL a
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OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho
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final OD of 1,8. Put that volum into an eppendorf tube with a hole in its tap.  
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volumen del cultivo.
+
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4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
+
4. Centrifugate 1 minute at 13000rpm.
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5. Eliminar el sobrenadante.
+
5. Discard the supernatant.
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6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de
+
6. Resuspend the pellet into 250μL of fresh medium with coelenterazine 2μM (aprox. 3,5μL of coelenterazinestock solution / μL de medio).
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coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).
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7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en
+
7. Incubate during 5,5 horas at ambient temperature, in agitation and keeping in the darkness.
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la oscuridad.
+
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8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a
+
8. Centrifugate 1 minute at 13000rpm. Discard the supernatant and resuspend in SD lacking Leu fresh medium without coelenterazine (see the proper volum below *).
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temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo
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sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se
+
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desee).
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9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la
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9. Wait 15 min (yeast luminiscence is increased due to a peak of Ca2+ is induced by the glucose (Nakajimashimada et
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glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et
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al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
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10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.
+
10. Measure basal luminiscence during 15 minutes.
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11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.
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11. Add the correct reactive volum to induce luminiscence.
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En el caso de inducción por pH alcalino:
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In the chase of alcaline induction:
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8. Añadir 173μL de medio
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8. *Add 170μL of medium.
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9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con
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9. Add 30μL of KOH 100mM.
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formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a
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4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre
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diferentes cepas.
+
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b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).
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10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal
+
Other stress types:
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durante 15 segundos.
+
-
 
+
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11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
+
-
 
+
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Otros tipos de estrés:
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NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
Line 85: Line 65:
KCl: 30μL KCl 100mM.
KCl: 30μL KCl 100mM.
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Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera
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Note: yeasts should be treated secuentialy and in the same way to obtain reproducible results.
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para tener resultados reproducibles.
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<div style="position:absolute; top:150px; left:580px; overflow:hidden;">
<div style="position:absolute; top:150px; left:580px; overflow:hidden;">

Revision as of 11:30, 3 October 2009














Protocol used to make our yeasts produce light


PROTOCOL OF CITOPLASMATIC Ca2+ INCREASEMENT MEASUREMENT IN S. cerevisiae


Modified from the original Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.

Material:

- pEVP11[AEQ] plasmid: apoaequorina expression (Batiza et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).

- Coelenterazine solution: Diluted coelenterazine until 590μM in satured N2 metanol. This compound is extremely photosensible and it's inhibited by O2. Keep at –20ºC.

Note: We bought Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de SIGMA. We put N2 gas into metanol during 5 minutes, and we added inmediately 200μL to the 50μg of coelenterazine.

- Luminometer.

- Luminometer tubes and ELISA plaques.

Procedure:

1. We recieved pEVP11[AEQ] aequorin transformed yeast from Joaquin Arinyo.

2. We let growing up o/n in SD lacking Leu medium to maintain plasmid expression.

3. After incubation, measure OD a 660nm y calculate the necessary volum to obtain in 250μL a final OD of 1,8. Put that volum into an eppendorf tube with a hole in its tap.

4. Centrifugate 1 minute at 13000rpm.

5. Discard the supernatant.

6. Resuspend the pellet into 250μL of fresh medium with coelenterazine 2μM (aprox. 3,5μL of coelenterazinestock solution / μL de medio).

7. Incubate during 5,5 horas at ambient temperature, in agitation and keeping in the darkness.

8. Centrifugate 1 minute at 13000rpm. Discard the supernatant and resuspend in SD lacking Leu fresh medium without coelenterazine (see the proper volum below *).

9. Wait 15 min (yeast luminiscence is increased due to a peak of Ca2+ is induced by the glucose (Nakajimashimada et al. (1991) PNAS 88; 6878-82).

10. Measure basal luminiscence during 15 minutes.

11. Add the correct reactive volum to induce luminiscence.

In the chase of alcaline induction:

8. *Add 170μL of medium.

9. Add 30μL of KOH 100mM.

Other stress types:

NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).

CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).

KCl: 30μL KCl 100mM.

Note: yeasts should be treated secuentialy and in the same way to obtain reproducible results.

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