Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols

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oxígeno. Guardar a –20ºC.
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Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
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SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir
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inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
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- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
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para mantener la expresión del plásmido.
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10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal
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11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
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Otros tipos de estrés:
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NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
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CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).
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KCl: 30μL KCl 100mM.
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Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera
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para tener resultados reproducibles.

Revision as of 12:00, 27 September 2009















PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34. Material: - Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62). - Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible oxígeno. Guardar a –20ºC. Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina. - Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador. - Tubos para el luminómetro. Procedimiento: 1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ]. 2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado para mantener la expresión del plásmido. 3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho volumen del cultivo. 4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente. 5. Eliminar el sobrenadante. 6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio). 7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en la oscuridad. 8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se desee). 9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et al. (1991) PNAS 88; 6878-82). 10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos. 11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada. En el caso de inducción por pH alcalino: 8. Añadir 173μL de medio 9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a 4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre diferentes cepas. b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa). 10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal durante 15 segundos. 11. Inyectar 30μL de KOH 100mM. Otros tipos de estrés: NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final). CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final). KCl: 30μL KCl 100mM. Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera para tener resultados reproducibles.

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