Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols

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(→Protocol used to make our yeasts produce light)
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PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO
PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO
CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae
CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae
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Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.
Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.
Material:
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- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al.
- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al.
(1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
(1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
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- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol
- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol
saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible
saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible
oxígeno. Guardar a –20ºC.
oxígeno. Guardar a –20ºC.
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Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir
SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir
inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
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- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
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- Tubos para el luminómetro.
- Tubos para el luminómetro.
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Procedimiento:
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1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].
1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].
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2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado
2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado
para mantener la expresión del plásmido.
para mantener la expresión del plásmido.
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3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una
3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una
OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho
OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho
volumen del cultivo.
volumen del cultivo.
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4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
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5. Eliminar el sobrenadante.
5. Eliminar el sobrenadante.
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6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de
6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de
coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).
coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).
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7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en
7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en
la oscuridad.
la oscuridad.
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8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a
8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a
temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo
temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo
sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se
sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se
desee).
desee).
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9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la
9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la
glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et
glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et
al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
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10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.
10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.
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11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.
11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.
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En el caso de inducción por pH alcalino:
En el caso de inducción por pH alcalino:
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8. Añadir 173μL de medio
8. Añadir 173μL de medio
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9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con
9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con
formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a
formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a
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diferentes cepas.
diferentes cepas.
b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).
b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).
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10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal
10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal
durante 15 segundos.
durante 15 segundos.
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11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
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Otros tipos de estrés:
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NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
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CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).
CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).
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KCl: 30μL KCl 100mM.
KCl: 30μL KCl 100mM.
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Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera
Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera
para tener resultados reproducibles.
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Revision as of 12:12, 27 September 2009














Protocol used to make our yeasts produce light


PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae

Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34. Material:

- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).

- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible oxígeno. Guardar a –20ºC.

Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.

- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.

- Tubos para el luminómetro.

Procedimiento:

1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].

2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado para mantener la expresión del plásmido.

3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho volumen del cultivo.

4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.

5. Eliminar el sobrenadante.

6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).

7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en la oscuridad.

8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se desee).

9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et al. (1991) PNAS 88; 6878-82).

10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.

11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.

En el caso de inducción por pH alcalino:

8. Añadir 173μL de medio

9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a 4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre diferentes cepas. b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).

10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal durante 15 segundos.

11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.

Otros tipos de estrés:

NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).

CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).

KCl: 30μL KCl 100mM.

Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera para tener resultados reproducibles.

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