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Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols
From 2009.igem.org
PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO
CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae
Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.
Material:
- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al.
(1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).
- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol
saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible
oxígeno. Guardar a –20ºC.
Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de
SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir
inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.
- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.
- Tubos para el luminómetro.
Procedimiento:
1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].
2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado
para mantener la expresión del plásmido.
3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una
OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho
volumen del cultivo.
4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.
5. Eliminar el sobrenadante.
6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de
coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).
7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en
la oscuridad.
8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a
temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo
sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se
desee).
9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la
glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et
al. (1991) PNAS 88; 6878-82).
10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.
11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.
En el caso de inducción por pH alcalino:
8. Añadir 173μL de medio
9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con
formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a
4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre
diferentes cepas.
b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).
10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal
durante 15 segundos.
11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.
Otros tipos de estrés:
NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).
CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).
KCl: 30μL KCl 100mM.
Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera
para tener resultados reproducibles.
