Team:Valencia/WetLab/YeastTeam/Protocols

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Protocol used to make our yeasts produce light


PROTOCOLO DE MEDIDA DE INCREMENTOS DE CALCIO CITOPLASMÁTICO EN S. cerevisiae


Modificado del protocolo seguido en Denis and Cyert (2002) JCB 156; 29-34.

Material:

- Plásmido pEVP11[AEQ] para la expresión de apoaequorina (Batiza et al. (1996) J.Biol.Chem. 271: 23357-62).

- Solución de Coelenterazina: Coelenterazina diluida hasta 590μM en metanol saturado con nitrógeno. Este compuesto es altamente fotosensible y sensible oxígeno. Guardar a –20ºC.

Nota: Compramos Coelenterazine, Native (CLZn) 50 μg Ref. C-2230 de SIGMA. Hay que gasear el metanol durante unos 5 minutos con N2 y añadir inmediatamente 200μL a los 50μg de coelenterazina.

- Luminómetro: Berthold LB9507 conectado a un computador.

- Tubos para el luminómetro.

Procedimiento:

1. Transformar las células con el plásmido pEVP11[AEQ].

2. Picar transformantes y crecer o/n hasta fase estacionaria en el medio apropiado para mantener la expresión del plásmido.

3. Medir OD a 660nm y calcular el volumen necesario para tener en 250μL una OD final de 1,8. Pasar a un tubo eppendorf con un agujerito en la tapa dicho volumen del cultivo.

4. Centrifugar a 13000rpm durante 1 minuto a temperatura ambiente.

5. Eliminar el sobrenadante.

6. Resuspender el pellet en 250μL de medio nuevo que contenga 2μM de coelenterazina (aprox. 3,5μL de la solución de coelenterazina / μL de medio).

7. Incubar durante 5,5 horas los cultivos a temperatura ambiente, en agitación y en la oscuridad.

8. Justo antes de realizar la medida centrifugar el tubo 1 minuto a 13000rpm a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante y resuspender en medio nuevo sin coelenterazina (el volumen de medio dependerá del tipo de inducción que se desee).

9. Esperar 15 min (la luminiscencia de las células se incrementa debido a que la glucosa induce un pico de calcio tal y como se describe en Nakajimashimada et al. (1991) PNAS 88; 6878-82).

10. Medir la luminiscencia basal durante unos 15 segundos.

11. Inyectar el volumen necesario de reactivo para provocar la inducción deseada.

En el caso de inducción por pH alcalino:

8. Añadir 173μL de medio

9. a) Separar 3μL de cultivo y fijarlas por dilución en 27μL de medio con formaldehido al 7% (35μL de formaldehido 37% en 500μL medio). Guardar a 4ºC para realizar contaje de células para normalizar los resultados entre diferentes cepas. b) 170μL restantes: esperar 15 minutos (pico de glucosa).

10. Pasar los 170μL a tubos del luminómetro y medir la luminiscencia basal durante 15 segundos.

11. Inyectar 30μL de KOH 100mM.

Otros tipos de estrés:

NaCl: 30μL NaCl 5M (0,75M final).

CaCl2: 30μL CaCl2 1.33M (200mM final).

KCl: 30μL KCl 100mM.

Nota: Se deben tratar las células secuencialmente y exactamente de la misma manera para tener resultados reproducibles.