Team:Heidelberg/Project German

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Project Highlights

• We are able to predict functional mammalian promoter sequences (go there)
• We have created a functional biochemical synthesis method for the generation of promoters libraries (go there)
• We have developed novel standards for measurement of promoters in mammalian cells (go there)
• 4 RFCs, well characterized parts (Parts) , (RFCs)
• First attempts to create a eukaryotic standard chassis (Stable Cell Line)
• Multicolor and multi-functional output devices for promoter characterization (Output)
• Isolation and characterization of natural promoters (Natural Promoters)

Project abstract

(English)
Synthetische Biologie, die sich mit Säugetierzellen befasst wird die medizinisch und Grundlagenforschung immens beschleunigen. Diesem riesigen Potential zum Trotz steckt die eukaryotische synthetische Biologie noch in den Kinderschuhen. Deshalb möchten wir den Grundstein für den methodischen Gebrauch von eukaryotischen Zellen als Chassis legen. Hierfür müssen zwei Prämissen getroffen werden: zum Ersten muss eine ausgereifte Klonierungsstrategie entworfen werden, und weiterhin müssen standardisierte Messmethoden etabliert werden, welche die Vergleichbarkeit und Kompatibilität von BioBrick Konstrukten ermöglichen. Zum Zweiten muss eine Bibliothek von biologischen Bausteinen zusammengestellt und erprobt werden. Bisher wurde noch kein Klonierungsstandard für Eukaryoten festgelegt, da es nur eine Hand voll eukaryotische Bausteine in der iGEM Registry gibt. Nach eingehender Untersuchung der bestehenden Standards haben wir uns daher für den BioBrick BB_2 proposal (Tom Knight) entschieden, um mit diesem weiter zu arbeiten. Die standardisierte Charakterisierung eukaryotischer Bausteine ist eine herausfordernde Aufgabe. Zu diesem Zweck haben wir standardisierte Methoden entwickelt die vergleichbare Messungen der Promotorstärke durch transiente Transfektion in Saeugetierzellen ermöglichen. Da jedoch Saeuetierzellen im Gegensatz zu Bakterien und Hefen, keine Plasmide vermehren, ist für eine optimierte Charakterisierung eine stabile Transfektion von Nöten. Um diese Notwendigkeit zu erfüllen haben wir eine stabile Zelllinie herangezogen welche auf Grund von FRT-Motiven innerhalb des Genoms in der Lage ist transfizierte Plasmide stabil in Selbiges zu integrieren. Wir haben eine Bibliothek von Promotoren zusammengestellt und damit Grundelemente jedes biologischen Baukastens zusammengetragen. Promotoren sind unabdingbar für die Regulation und differentielle Genexpression, welche beide fundamentale Elemente für sowohl natürliche als auch synthetische Biologie darstellen. Nichtsdestoweniger sind natürliche Promotoren oft einem sehr komplexen Regulationsmechanismus unterworfen, welche unerquicklicher Weise die Herstellung von stabilen synthetischen Netzwerken erschweren. Daher haben wir eine Synthesemethode für künstliche Promotoren entwickelt und diese erfolgreich angewandt. Unsere Promotoren können von bestimmten Transkriptionsfaktoren induziert werden. Wir glauben, dass wir mit unserer neuen Methode jegliche Art von spezifischem Promotor synthetisieren können. Geplantes Promotordesign erfordert in silico Methoden; auf der Basis der Untersuchung von mehr als 4000 Promotorsequenzen aus dem menschlichen Genom, können wir funktionelle Sequenzen für Promotoren vorhersagen, die nur die Transkriptionsfaktorbindestellen enthalten die vom Nutzer gewünscht sind. Die dazu notwendigen Informationen sind in der HEARTBEAT (Heidelberg Artificial Transcription Factor Binding Site Engineering and Assembly Tool) Datenbank gespeichert. HEARTBEAT verfügt über eine grafische Oberfläche welche es dem Nutzer erlaubt Promotoren nach seinem Gusto und den angestrebten Aufgabenstellungen schneidern zu lassen. Des Weiteren nutzen wir „Fuzzy Logic“, um das Verhalten unserer Promotoren zu simulieren und dadurch unsere Inputsequenzen zu optimieren. Wir haben gezeigt, dass HEARTBEATsequencen in vivo funktionieren. Synthetische Promotoren haben großes Potential in der Grundlagenforschung, da sie zum Beispiel das Design eines Assays zur zeitgleichen Beobachtung mehrerer Signalwege in der Zelle ermöglichen. Zu guter Letzt ist kontrollierbare Genexpression auch eine interessante Anwendung in der Medizin.