Team:EPF-Lausanne/Protocols/Digestion

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If the DNA preps are not concentrated enough, you can add more DNA and increase the volume of the reaction, respecting the buffers concentration (10x). Complete with dH2O if needed.
If the DNA preps are not concentrated enough, you can add more DNA and increase the volume of the reaction, respecting the buffers concentration (10x). Complete with dH2O if needed.
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==Dephosphorylation==
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Add 1 µl of artic phosphatase to the vector to prevent ligation of the vector on itself.
Add 1 µl of artic phosphatase to the vector to prevent ligation of the vector on itself.
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Incubation
 
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Vector: 1h @ 37°C → add artic phophatase → 20min @ 37°C
 
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Enzyme properties - www.neb.com
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==Incubation==
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NEB 1 NEB 2 NEB 3 NEB 4 BSA Inactivation
NEB 1 NEB 2 NEB 3 NEB 4 BSA Inactivation

Revision as of 07:41, 4 September 2009



Contents

Digestion Protocol




We want to have all the DNA preps at 700 ng/µl, for the vector as for the insert. If the DNA preps are not concentrated enough, you can add more DNA and increase the volume of the reaction, respecting the buffers concentration (10x). Complete with dH2O if needed.


Reaction Mix

DNA 7 µl (700 ng of 100 ng/µl prep)
NEB buffer 10x 1 µl
BSA 10x 1 µl
Enzyme 1 0.5 µl
Enzyme 2 0.5 µl
dH2O 0 µl
Total 10 µl



Dephosphorylation

Add 1 µl of artic phosphatase to the vector to prevent ligation of the vector on itself.


Incubation

Vector: 1h @ 37°C → add artic phophatase → 20min @ 37°C
Insert: 1h20min @ 37°C


Enzyme properties - www.neb.com

Titre du tableau
Titre col. A Titre col. B Titre col. C Titre col. D
Titre ligne 1 donnée L1-A donnée L1-B donnée L1-C donnée L1-D
Titre ligne 2 donnée L2-A donnée L2-B donnée L2-C donnée L2-D
Titre ligne 3 donnée L3-A donnée L3-B donnée L3-C donnée L3-D
Titre ligne 4 donnée L4-A donnée L4-B donnée L4-C donnée L4-D


NEB 1 NEB 2 NEB 3 NEB 4 BSA Inactivation EcoRI 100 100 100 100 optional 20min @ 65°C SpeI 75 100 25 100 X 20min @ 80°C XbaI 0 100 75 100 X 20min @ 65°C PstI 75 75 100 50 X 20min @ 80°C NotI 0 50 100 25 X 20min @ 65°C


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