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Team:EPF-Lausanne/Protocols/Digestion
From 2009.igem.org
We want to have all the DNA preps at 700 ng/µl, for the vector as for the insert. If the DNA preps are not concentrated enough, you can add more DNA and increase the volume of the reaction, respecting the buffers concentration (10x). Complete with dH2O if needed.
Reaction Mix
| DNA | 7 µl (700 ng of 100 ng/µl prep) |
|---|---|
| NEB buffer 10x | 1 µl |
| BSA 10x | 1 µl |
| Enzyme 1 | 0.5 µl |
| Enzyme 2 | 0.5 µl |
| dH2O | 0 µl |
| Total | 10 µl |
Dephosphorylation
Add 1 µl of artic phosphatase to the vector to prevent ligation of the vector on itself.
Incubation
- Vector: 1h @ 37°C → add artic phophatase → 20min @ 37°C
- Insert: 1h20min @ 37°C
Enzyme properties - www.neb.com
| Titre col. A | Titre col. B | Titre col. C | Titre col. D | |
|---|---|---|---|---|
| Titre ligne 1 | donnée L1-A | donnée L1-B | donnée L1-C | donnée L1-D |
| Titre ligne 2 | donnée L2-A | donnée L2-B | donnée L2-C | donnée L2-D |
| Titre ligne 3 | donnée L3-A | donnée L3-B | donnée L3-C | donnée L3-D |
| Titre ligne 4 | donnée L4-A | donnée L4-B | donnée L4-C | donnée L4-D |
NEB 1 NEB 2 NEB 3 NEB 4 BSA Inactivation
EcoRI 100 100 100 100 optional 20min @ 65°C
SpeI 75 100 25 100 X 20min @ 80°C
XbaI 0 100 75 100 X 20min @ 65°C
PstI 75 75 100 50 X 20min @ 80°C
NotI 0 50 100 25 X 20min @ 65°C
