"
Team:SupBiotech-Paris/Concept3Fr
From 2009.igem.org
Introduction Thérapies actuelles Thérapies géniques Le DVS Concept Vecteur Tissulaire Vecteur Cellulaire Plasmide thérapeutique Conclusion Mise en application Ciblage Tissulaire Action antitumorale Modeling du traitement Conclusion
BioBricks Matériel & Méthode Bibliographie
Contents |
Le plasmide thérapeutique
Le plasmide thérapeutique a pour fonction d’exprimer le ou les gènes thérapeutiques répondant à la physiopathologie ciblée.
Il doit posséder deux caractéristiques essentielles, se faire encapsider au sein du vecteur cellulaire, le phage lambda, et avoir la capacité d’atteindre le noyau de la cellule cible.
Vous allez pouvoir découvrir au cours de ce chapitre quelles ont été les stratégies mises en place pour répondre à ces problématiques.
L’encapsidation au sein du vecteur cellulaire [1,2,3,4,5,6]
Lors du processus d’assemblage du phage lambda, l’encapsidation du génome au sein de la capside est assurée par la présence à ses extrémités de séquences spécifiques appelées séquences Cos. Ces séquences sont placées sur le plasmide thérapeutique. Et afin de garantir sa seule encapsidation au sein du vecteur cellulaire, ces dernières ont été excisées du génome phagique. De ce fait, si le vecteur cellulaire vient à infecter une bactérie de l’organisme, cela n’aboutira pas à sa destruction et à la propagation d’une quelconque infection. Le vecteur cellulaire, intégrant uniquement le plasmide thérapeutique, n’est en aucun cas réplicatif et ne possède donc aucune pathogénicité envers la population bactérienne commensale.
Les séquences Cos sont composées de trois sites spécifiques : CosN, CosB et CosQ.
CosN correspond au site de coupure du concatémère d’ADN de la terminase (une enzyme produite lors de la phase lytique) qui va alors générer les extrémités cohésives de l’ADN mature (les séquences Cos) et initier l’encapsidation du génome (CosB étant le site de fixation de la terminase). CosQ est en revanche nécessaire en tant que séquence d'arrêt de l’encapsidation, elle agit en concordance avec les sites CosN et I2 (une séquence située entre cosN et cosB).
Il a également été démontré que l’initiation de la coupure au niveau de CosN est aidée par l’IHF, l’Intégration Host Factor, lors du processus d’encapsidation. Ce dernier provoque une courbure de l’ADN en se fixant au niveau de I1 (une sous-séquence de CosB) permettant à gpNu1 (la sous-unité de la terminase ne portant pas l’activité d’endonucléase) de se fixer sur les sites R(1,2,3) de cosB. Cette fixation déclenche l’activité d’endonucléase de la sous-unité gpA de la terminase libérant un monomère génomique prêt à être encapsidé.
En résumé, la terminase se fixe sur une séquence Cos du concatémère d’ADN et provoque une coupure qui libère l’extrémité gauche du génome à encapsider. C’est la liaison du complexe enzyme-DNA à une procapside vide qui initie le processus d’encapsidation.
Ayant retiré les séquences Cos du génome phagique, il n’est jamais encapsidé. Seul le plasmide thérapeutique, les possédant, l’est.
Le ciblage nucléaire [7]
Le vecteur cellulaire libère, après une étape d’endocytose, le plasmide thérapeutique dans le cytoplasme de la cellule cible. Cependant, le plasmide doit absolument pénétrer le noyau pour assurer sa stabilité et son expression. Un plasmide quelconque n’atteindra que très rarement le noyau si on ne lui fournit pas, à la base, les éléments nécessaires au déclenchement d’un mécanisme d’incorporation nucléaire. Des études ont été menées sur l’utilisation de séquences spécifiques permettant l’importation nucléaire de séquences génétiques : les séquences DTS (Dna nuclear targetting sequence). La séquence SV40 du simian virus est bien connue pour jouer ce rôle.
5’ GCATGCTTTG CATACTTCTG CCTGCTGGGG AGCCTGGGGA CTTTCCACAC CCTAACTGAC ACACATTCCA CAGCTGGTTC TTTCCGCCTC AGAAGGTACC T 3’
Cette séquence, reconnue pour avoir la capacité de se lier à 10 facteurs transcriptionnels distincts, assure le cheminement de l’ADN jusqu’au noyau. Ajoutée au plasmide thérapeutique, cette séquence garantie l’entrée et l’expression du plasmide thérapeutique au sein du noyau de la cellule cible.
Les gènes thérapeutiques
Le plasmide thérapeutique possède le ou les gènes à apporter à la cellule malade pour répondre à une pathologie ciblée. S’agissant de gènes naturellement présents au sein du génome cellulaire, nous avons choisi de les placer sous le contrôle de leur promoteur naturel. De ce fait, la cellule n’est jamais contrainte de quoi que soit, aucune pression n’est exercée sur son métabolisme. Les gènes sont produits uniquement lorsqu’ils sont requis. Cette précaution assure une certaine sécurité quant à la toxicité qui peut-être liée à l’internalisation du plasmide dans une cellule saine.
En résumé…
…, le DVS possède un plasmide thérapeutique ayant les caractéristiques suivantes :
- une séquence assurant son encapsidation au sein du vecteur cellulaire,
- une séquence assurant son acheminement jusqu’au noyau,
- un ou plusieurs gènes thérapeutiques,
- une cassette de résistance permettant la sélection des bactéries transformées.
