Team:SupBiotech-Paris/Matériel & Méthode

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Latest revision as of 02:29, 21 October 2009

Projet

Introduction Thérapies actuelles Thérapies géniques Le DVS Concept Vecteur Tissulaire Vecteur Cellulaire Plasmide thérapeutique Conclusion Mise en application Ciblage Tissulaire Action antitumorale Modeling du traitement Conclusion

Ressources

BioBricks Matériel & Méthode Bibliographie

Ethique & sûreté

Éthique Sûreté

Electrophorèse

Matériel

Template d’ADN
Tampon de charge
Marqueur de taille moléculaire
Tampon TAE 1X
Bromure d’éthidium (BET)
Agarose
Matériel de migration et de détection pour électrophorèse en gel d’agarose

Procédure

1. Préparation du gel d’agarose :
a) Pour les bio-briques :
Préparer un gel d’agarose à 2% (1,5 gramme d’agarose dans 100mL d’H2O bidistillée + 15µL de BET).
b) Pour isoler l’ADN du phage lambda :
Préparer un gel d’agarose à 0,7% (0,4 gramme d’agarose dans 100mL d’H2O bidistillée + 15µL de BET).
2. Mettre l’agarose à chauffer aux micro-ondes 5 à 10 minutes.
3. Préparer la plaque d’électrophorèse.
Faire bien attention à l’étanchéité de la plaque.
4. Ajouter le tampon TAE 1X jusqu’à recouvrir le gel d’agarose.
5. Préparer les échantillons.
Mélanger 5µL de tampon de charge pour 15µL d’échantillon d’ADN.
Préparer le marqueur de taille moléculaire si besoin :
High range : 0,5µL d’ADN + 1µL Tampon de charge du marqueur + 4,5µL d’H2O bi distillée.
6. Vortexer puis centrifuger 2 secondes.
7. Déposer délicatement les échantillons et le marqueur de masse moléculaire.
Ne pas utiliser les puits situé sur les coté du gel.
Déposer le marqueur de masse moléculaire au centre du gel pour faciliter l’analyse de la taille des échantillons.
Une plaque 8 puits a une contenance d’environ 45µL d’échantillon.
Une plaque 15 puits peut contenir 15µL d’échantillon.
7. Placer les électrodes de la cuve d’électrophorèse en sorte que l’ADN migre de l’anode vers la cathode.
8. Déclencher la migration du gel de 85 volts à 130 volts pendant 45 à 80 minutes.
Vérifier qu’il y a bien apparition de bulles due au courant électrique et que l’ADN migre dans le bon sens.

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Extraction d’ADN à partir d’un gel d’agarose (Nucleospin Clontech)

Matériel

30ml de tampon NT
14ml de tampon NT3
15ml de tampon NE
50 colonnes Nucleospin Extract II
50 tubes collecteurs Nucleospin (2ml)
Scalpel stérile
Balance
Vortex
Incubateur (50°C)
Centrifugeuse (11000g)
Tubes 1.5ml stérile

Procédure

1. Exciser un fragment du gel d’agarose contenant le fragment d’ADN, avec le scalpel, en prenant soin de réduire au minimum le volume de gel.
2. Déterminer le poids de la tranche de gel et la transférer à un tube stérile.
3. Pour chaque 100 mg gel d'agarose ajouter 200μl de tampon NT.
Pour les gels contenant plus de 2% d'agarose, doubler du volume de tampon NT.
Le poids maximal par tranche de gel, par NucleoSpin® Extract II, est de 400 mg ou 200 mg pour les pourcentages élevés (> 2%), dans ce cas, 2 étapes sont nécessaires (étapes de liaison de l’ADN : 6 et 7).
4. Incuber les échantillons à 50 ° C jusqu'à ce que le gel soit dissout (5-10 min).
5. Vortexer l'échantillon brièvement tous les 2 à 3 min jusqu'à ce que le gel soit complètement dissout.
6. Placer une colonne NucleoSpin ® Extrait II dans un tube collecteur Nucleospin de 2 ml et mettre l'échantillon, puis centrifuger pendant 1 min à 11000g.
7. Jeter la solution contenue dans le tube collecteur Nucleospin et replacer la colonne NucleoSpin Extract II ® dans le même tube collecteur Nucleospin.
8. Ajouter 600μl de tampon NT3 et centrifuger pendant 1 min à 11000g.
9. Jeter la solution contenue dans le tube collecteur Nucleospin et replacer la colonne NucleoSpin Extract II ® dans le tube collecteur Nucleospin.
10. Centrifuger pendant 2 min à 11000g pour supprimer le tampon NT3.
Assurez-vous que la colonne Nucleospin ne soit pas en contact avec la solution éluée lors de la centrifugation (dans le tube collecteur Nucleospin).
L'éthanol résiduel issu du tampon NT3 inhibe les réactions ultérieures et doit être retiré à cette étape. En plus de la centrifugation, une suppression totale peut être réalisée à partir d’une incubation de la colonne NucleoSpin ® Extrait II pendant 2-5 min à 70°C avant l'élution.
11. Placer la colonne NucleoSpin ® Extract II dans un tube propre de 1,5 ml.
12. Ajouter 15-50μl de tampon d'élution NE, puis incuber à température ambiante pendant 1 min pour augmenter le rendement de l'ADN élué.
13. Centrifuger pendant 1 min à 11000g.
Le rendement des grands fragments (> 5-10 kb) peut être augmenté par l'utilisation de tampon d'élution préchauffé (70 ° C): Pour l'élution, ajouter des tampons d'élution préchauffée et incuber à température ambiante pendant 1 min avant de recueillir l'éluant par centrifugation.

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Préparation d’Escherichia coli électrocompétentes

Matériel

500µl de culture d’E.Coli dans du milieu de culture LB
Milieu de culture LB
60ml de glycérol à 10%
Ethanol
Incubateur avec rotation
Bac de Glace
Tubes de 1.5ml
Tubes Falcon 50ml
Tubes pour centrifugeuse 300ml
Centrifugeuse réfrigérée à 4°C

Procédure

0. Préparer une pré-culture d’E.Coli dans 5ml de milieu de culture LB (toute la nuit à 37°C avec rotation).
Préparer la centrifugeuse à 4°C
1. Mettre la pré-culture d’E.Coli dans 450ml de milieu de culture LB et incuber à 37°C avec agitation pendant 3 heures.
2. Placer 225ml de la solution dans 2 tubes pour centrifugeuse.
3. Placer les deux tubes dans la glace pendant 15 minutes.
4. Centrifuger à 2000g pendant 10 minutes à 4°C.
7. Eliminer le surnageant et remettre délicatement en suspension avec 200ml d’eau froide stérile.
Ajouter d’abord 10 à 20ml d’eau froide stérile et resuspendre par pipetage, puis ajouter le reste des 200ml.
8. Centrifuger à 2000g pendant 10 minutes à 4°C.
9. Eliminer le surnageant et remettre délicatement en suspension avec 200ml d’eau froide stérile. Ajouter d’abord 10 à 20ml d’eau froide stérile et resuspendre par pipetage, puis ajouter le reste des 200ml.
10. Placer les tubes dans la glace pendant 30 minutes.
11. Centrifuger à 2000g pendant 15 minutes à 4°C.
12. Eliminer le surnageant et remettre délicatement en suspension avec 25ml de glycérol à 10%.
On peut éventuellement transférer la solution dans un tube Falcon de 50ml.
13. Placer les tubes dans la glace pendant 30 minutes.
14. Centrifuger à 1500g pendant 15 minutes à 4°C.
15. Eliminer le surnageant et ajouter 500µl de glycérol à 10%.
16. Resuspendre les cellules dans un volume total de 1ml.
17. Aliquoter 50µl par tube (tubes déjà dans la glace).
18. Stocker à -80°C

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Electroporation d’Escherichia coli électrocompétentes

Matériel

Milieu LB liquide
Milieu LB solide (milieu de culture LB + agarose + antibiotique adapté)
Bactéries Escherichia coli électrocompétentes congelées (40 microlitres dans un tube eppendorf)
ADN
Bac rempli de glace
Cuvettes d’électroporation (2 mm)
Electroporateur
Etuve avec agitation

Procédure

0. Placer la cuvette d’électroporation dans de la glace.
1. Mettre le tube contenant les bactéries (environ 40 microlitres) à température ambiante, afin de dégeler le milieu. Le placer ensuite dans de la glace.
2. Régler l’électroporateur avec les paramètres suivants :

3. Ajouter un microlitre de la solution d’ADN au tube contenant les bactéries.
4. Placer le tube une minute dans la glace.
5. Transférer le contenu du tube dans la cuvette d’électroporation.
6. Sécher l’extérieur de la cuvette avec du papier absorbant. La mettre dans le compartiment prévu de l’électroporateur.
7. Déclencher le pulse.
8. Rajouter immédiatement 1mL de milieu de culture dans la cuvette.
Attention : un retard de 3 minutes diminue l’efficacité de la transformation de 90%.
9. Transférer le contenu de la cuvette dans un tube. Le mettre à incuber une heure à 37°C sous agitation.
Tremper les cuvettes quelques minutes dans de l’eau de javel. Les rincer abondamment avec de l’eau du robinet, puis avec de l’eau bidistillée et de l’éthanol à 70% (pas d’acétone), avant de les laisser sécher. Elles pourront ainsi être réutilisées.
10. Mettre les bactéries en culture sur un milieu LB solide.

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Préparation de Mycobacterium électrocompétentes

Matériel

500μl de Culture de Mycobacterium à -80°C
Glycérol 10%
Tubes de 1.5ml
Centrifugeuse

Procédure

0. Toute la manipulation se déroule et tous les milieux sont à température ambiante.
1. Transférer les cellules de votre échantillon congelé dans des tubes de centrifugation.
2. Centrifuger les cellules à 3600rpm pendant 10 min, puis éliminer le surnageant.
3. Laver les cellules avec 1/2 volume (25ml) du glycérol 10% stérile en pipetant doucement jusqu’à ce que la masse de cellules soit dissoute.
4. Laver et culotter les cellules comme l’étape 2 et 3; avec 1/4 vol (12.5ml) de glycérol 10% stérile.
5. Laver et culotter les cellules comme l’étape 2 et 3; avec 1/8 vol (6,75ml) de glycérol 10% stérile.
6. Laver et culotter les cellules comme l’étape 2 et 3; avec 1/10 vol (5ml) de 10% glycérol stérile.
7. Laver et culotter les cellules comme l’étape 2 et 3; avec 1/25 vol (2ml) de 10% glycérol stérile.
8. Aliquoter 100μL de cellules dans des tubes de 1,5ml.
9. Laisser refroidir rapidement dans un bain de glace.
10. Puis stocker à -80°C, ou utiliser immédiatement (efficacité de l’électrotransfert augmentée).

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Electroporation de Mycobacterium électrocompétentes

Matériel

Milieu Loewenstein liquide
Milieu Loewenstein solide (milieu de culture Loewenstein coagulé + antibiotique adapté)
Mycobacterium électrocompétentes congelées (40 microlitres dans un tube)
ADN
Bac rempli de glace
Cuvettes d’électroporation (2 mm)
Electroporateur
Etuve avec agitation

Procédure

0. Placer la cuvette d’électroporation dans de la glace.
1. Mettre le tube contenant les bactéries (environ 40 microlitres) à température ambiante afin de dégeler le milieu. Le placer ensuite dans de la glace.
2. Régler l’électroporateur avec les paramètres suivants :

3. Ajouter un microlitre de la solution d’ADN au tube contenant les bactéries.
4. Placer le tube une minute dans la glace.
5. Transférer le contenu du tube dans la cuvette d’électroporation.
6. Sécher l’extérieur de la cuvette avec du papier absorbant. La mettre dans le compartiment prévu de l’électroporateur.
7. Déclencher le pulse.
8. Rajouter immédiatement 1mL de milieu de culture dans la cuvette.
Attention : un retard de 3 minutes diminue l’efficacité de la transformation de 90%.
9. Transférer le contenu de la cuvette dans un tube. Le mettre à incuber une heure à 37°C sous agitation.
Tremper les cuvettes quelques minutes dans de l’eau de javel. Les rincer abondamment avec de l’eau du robinet, puis avec de l’eau bidistillée et de l’éthanol à 70% (pas d’acétone), avant de les laisser sécher. Elles pourront ainsi être réutilisées.
10. Mettre les bactéries en culture sur un milieu Loewenstein solide.

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Restriction

Matériel

10µL d’ADN (1µL pour 0,5µg d'ADN)
3µL de tampon de restriction (1X du volume total)
1µL d’enzyme de restriction
3µL BSA (1X du volume total)
15µL d’eau distillée stérile
Volume Total 30µL
Tubes de 1.5ml

Procédure

1. Dans un tube eppendorf stérile.
2. Mettre Tampon 3µL de tampon.
3. Ajouter l'ADN.
4. Ajouter 3µL de BSA.
5. Puis, ajouter 1µL d’enzymes de restriction.
6. Et compléter avec l’eau distillée stérile.
VOLUME TOTAL = 30µL.
7. Mettre dans un thermocycler avec les conditions:

NOTE : si on peut laisser plus de 6h d'incubation pour la restriction, laisser plus longtemps pour avoir une restriction de meilleure qualité!

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Linéarisation

Matériel

Template d’ADN
1µl de phosphatase alcaline
3µl de tampon de phosphatase alcaline
Eau Pure Volume total 30µl
Bain marie ou plaque chauffante
Tubes de 1.5ml

Procédure

0. Préparer un bain marie à 37°C.
1. Ajouter le tampon de la phosphatase alcaline concentration 1X dans le template d’ADN, soit 3µL de tampon pour 30µL de volume final.
2. Ajouter 1µL d’alkaline phosphatase.
3. Incuber 1 heure à 37°C.
4. Inactivation par la chaleur de la phosphatase alcaline 5 minutes à 65°C.
Procéder à la ligation juste après la linéarisation.

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Ligation

Matériel

3µl de tampon de ligation 10X
1µl de T4 DNA Ligase
100 à 1000µg en solution d’insert d’ADN
1µl de vecteur d’ADN à 0.05g/l
Eau stérile pour un volume final de 30µl
Tubes de 1.5ml

Procédure

1. Dans un tube de 1,5ml, mettre 2µl de tampon de ligation.
2. Ajouter l’insert d’ADN ainsi que 1µl de vecteur.
3. Ajouter 1µl de T4 DNA Ligase.
4. Compléter avec de l’eau stérile pour avoir 30µl de volume final.
5. Laisser agir pendant 35 minutes à 22.5°C.
6. Dénaturer la T4 DNA Ligase à 65°C pendant 10 minutes.

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PCR (Kit Promega)

Matériel

Template d’ADN
Primer 5’ à 3’
Primer 3’ à 5’
GoTaq Hot Start Green Mix (Promega)
Thermocycler

Procédure

1. Mettre le kit GoTaq Hot Start Green mix à température ambiante, vortexer puis centrifuger brièvement pour concentrer le mix au fond du tube.

2. Préparer le mix de PCR suivant :

a. Pour 25µL :

b. Pour 50µL :

c. Pour 100µL :

3. Ajouter dans l'ordre donné dans les tableaux.

Faire attention à bien insérer les volumes de primers, de template sur les bords du tube afin de voir tous les volumes déposés.

4. Vortexer le volume total

5. Centrifuger "Start - stop" (2 à 5 secondes)

Si le thermocycler n'a pas de couvercle chauffant ajouter 1 à 2 gouttes d'huile minérale stérile.

6. Insérer la préparation dans le thermocycler, puis lancer les cycles

Cycles :

7. Vérifier vos produits de PCR par électrophorèse.

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