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Le vecteur tissulaire

Le vecteur tissulaire à pour fonction d’amener le vecteur cellulaire jusqu'à l’organe d’intérêt, celui comportant la cellule cible.
Il doit posséder trois caractéristiques importantes. En tant que vecteur de type bactérien, il ne doit pas être pathogène pour le patient, ou du moins peu dangereux. Ensuite, il doit avoir un tropisme intéressant, c'est-à-dire avoir la capacité d’atteindre l’organe cible. Et pour finir, sa caractéristique la plus importante, doit être de pouvoir déjouer le système immunitaire, afin de ne pas être détruit ou éliminé avant d’avoir atteint ses objectifs.

Vous allez pouvoir découvrir au cours de ce chapitre de quelles manières et sur quelles caractéristiques nous nous somme basés pour choisir la meilleure bactérie. Puis, vous découvrirez plus en détail ses caractéristiques au travers des différentes contraintes imposées par le DVS concernant sa pathogénicité, sa résistance et son tropisme. Enfin, nous vous présenterons les améliorations apportées à cette bactérie pour en faire un vecteur tissulaire optimal.

Notre vecteur tissulaire : Mycobacterium Avium [1]

Nous avons étudié plusieurs types bactériens pour obtenir le meilleur rapport entre, faible pathogénicité, tropisme intéressant et résistance au système immunitaire, afin de choisir au mieux notre vecteur tissulaire.
Une tache ardu, puisqu’en règle générale, un microorganisme qui résiste au système immunitaire est potentiellement dangereux pour son hôte. Il fallait donc trouver un microorganisme résistant mais ne possédant pas une haute pathogénicité pour l’Homme. Etant plus facile de réduire la pathogénicité que d’améliorer la résistance, nous avons déterminé le dernier facteur comme prioritaire pour la sélection.

Nous avons tous d’abord répertorié les types et espèces bactériennes qui présentent une résistance au système immunitaire. Les quatre plus connus étant :

- Mycobacterium et notamment Mycobacterium tuberculosis, agent responsable de la tuberculose;
- Legionella pneumophila, agent responsable de la légionellose;
- Listeria monocytogenes, agent responsable de la méningite;
- Coxiella burnetii, agent responsable de la coxiellose (fièvre Q).

Toutes les quatre sont bien évidemment hautement pathogènes, nous nous sommes donc penchés sur des homologues ou des sous-espèces peu pathogènes pour l’homme.
Mycobacterium avium (M.avium) est celle qui a retenu notre attention. Cette dernière appartient au genre des Mycobactéries, et plus précisément au Complexe Mycobacterium Avium (MAC).

La manifestation clinique d'infections par M.avium peut inclure une toux productive, de la fatigue, de la fièvre, une perte de poids et des sueurs nocturnes. Les symptômes des infections à M.avium découlent de la colonisation du tractus respiratoire ou gastro-intestinal et de la diffusion possible à d'autres endroits du corps. Contrairement à Mycobacterium tuberculosis, les M.avium sont peu pathogènes; c'est pourquoi elles peuvent coloniser des sujets sans avoir d'effets indésirables sur la santé. Les sujets immunocompétents qui n'ont pas de maladie sous-jacente ont un très faible risque de présenter des symptômes d'infection par M.avium. Des comptes rendus ont montré récemment que l'on retrouve de plus en plus la présence de M.avium chez des sujets, notamment des femmes, qui ne semblent avoir aucun trouble pulmonaire ou immunitaire prédisposant. La majorité des sujets en bonne santé qui sont atteints d'infections causées par des M.avium ont une infection localisée; par contre, on constate des infections par M.avium disséminées chez un pourcentage important de patients atteints du SIDA (80 % des patients colonisés), ainsi que chez d'autres populations dont le système immunitaire est déficient, comme les sujets qui ont un syndrome d'immunodéficience combinée aiguë ou qui ont reçu une transplantation et les patients traités aux corticostéroïdes ou avec des médicaments cytotoxiques.

M.avium semble être un candidat intéressant pour le vecteur tissulaire (lien non pas vers ce chapitre mais le DVS partie VT). Nous l’avons donc sélectionné.

Métabolisme et croissance du vecteur tissulaire [2]

Le métabolisme de notre bactérie représente un aspect essentiel quant au design du DVS. Sa connaissance nous permettra de définir les besoins de notre bactérie ou d’estimer au mieux son taux de croissance en fonction de l’environnement dans lequel elle se trouve.

De nombreuse études portent sur la paroi ou sur la pathogénicité du Mycobacterium mais peu sur son métabolisme. Or, il est primordial d’avoir accès à ce type d’information si l’on veut contrôler voir optimiser les capacités de cette dernière.

Les données concernant son métabolisme enzymatique (anabolisme et catabolisme), le cycle du carbone ou celui de l’azote restent peu fournis mais certaines études ont fait la lumière sur son mécanisme de réplication.
La croissance de M.avium est complexe et demande un apport énergétique très important. Elle divise en trois étapes :

(i) Dans un premier temps, les cellules s’allongent tandis qu’elles synthétisent d’importante quantité d’acides gras et augmentent leurs concentration en protéines et ADN.
(ii) Vient alors l’étape de fission binaire, un processus au terme duquel une cellule mère donne deux cellules filles après la mise en place d’un sillon de séparation. Avant la division à proprement dite, on observe une diminution de la synthèse protéique et une baisse importante de la concentration en acides gras (principalement des triglycérides). Ceci étant du à la demande très élevé en énergie qu’impose ce processus. A la fin de la deuxième étape, les bactéries adoptent une forme de cocobacille.
(iii) La séparation « physique » des cellules filles constitue la troisième et dernière étape de la réplication. Utilisé comme source de carbone et d’énergie, les acides palmitiques et oléiques sont primordiales à ce stade de la réplication, le glycérol et le glucose ne pouvant satisfaire la demande énergétique qu’implique le processus de fission.

Les M.avium ont un temps de génération plutôt long, de l’ordre de 20 heures, une caractéristique commune aux mycobactéries. Certaines souches ont des temps de génération variant de 2 à 200 heures. Cette caractéristique est un avantage, elle permet d’empêcher la propagation trop rapide et incontrôlable de notre vecteur, en revanche elle peut être un problème lors de la production. Mais M.avium reste tout de même un organisme procaryote, donc possédant une croissance rapide.

Résistance au système immunitaire du vecteur tissulaire [3,4,5]

Le système immunitaire peut s’avérer être un ennemi redoutable, détectant et éliminant tout ce qui n’appartient pas à l’organisme. Ne pouvant être furtif à ce dernier, il faut être « blindé ».

Mécanisme de résistance de M.avium

Les bactéries comme Mycobacterium avium ont développées des stratégies de résistance hautement spécifiques pour déjouer le système immunitaire.
Ainsi M.avium, étant un microorganisme intracellulaire facultatif, possède la capacité d’infecter certaines cellules du système immunitaire que sont les macrophages ou les cellules dendritiques, responsables de la phagocytose. L’infection engendrant la mort de ces phagocytes, on observe chez l’hôte une diminution de son immunité non spécifique.
Afin de lutter contre le macrophage, M.avium inhibe la maturation des phagolysosomes, responsable de la lyse de ces dernières. Le paradigme de ce mécanisme n’est pas encore déterminé, mais l’hypothèse principale implique l’un des glycolipides de la paroi, le lipoarabinomannan.

Pour lutter contre les cellules dendritiques, M.avium dérègle les signaux de transduction cellulaire en libérant certaines enzymes régulant le taux de messagers secondaires. En effet, M.avium possède, dans son génome, 12 gènes contenant des domaines d’adenylate cyclases de classes III, dont la plus importante, Rv0386, qui facilite la formation d’AMPc dans les macrophages. L’AMPc étant un messager secondaire qui mène à la synthèse de cytokines pro-inflammatoire TNF-
Or, on sait qu’à forte concentration, le TNF- bloque la maturation des cellules dendritiques et donc le déclenchement de la réponse immunitaire.

M.avium ne « craignant rien » face au système immunitaire son élimination est faible. Elle a alors la capacité de persister dans l’organisme et donc plus de chance d’atteindre sa cible et de s’y implanter.

Paroi cellulaire et enveloppe de M.avium

La capacité de Mycobacterium à résister au système immunitaire réside dans sa paroi et son enveloppe cellulaire. Ces dernières présentent une structure complexe et spécifique aux Mycobactéries.
L’enveloppe est composée de nombreux éléments. Certain, comme les protéines solubles, les carbohydrates, et les lipides sont des plus communs et ne présente rien de spécifique à M.avium.
D’autre, en revanche, sont des plus intéressant, notamment ces trois macromolécules insolubles :

- l’arabinogalactan,
- le peptidoglycane,
- l’acide mycolique.

Ensemble, ces 3 constituants forment le cœur mycoylarabinogalactanpeptidoglycane (MAGP) de la paroi cellulaire. Le MAGP représente un des deux lipopolysaccharides (LPS) commun à toutes les mycobactéries, mais M.avium possède un second LPS : le lipoarabinomannan. Le lipoarabinomannan n’est pas lié de façon covalente au MAGP mais ancré dans la membrane plasmique de la mycobactérie.
On observe également, chez M.avium, une couche de glycopeptidolipides (GPL) tout aussi spécifique.
Toute cette structure (MAGP, GPL et lipoarabinomannan) est fortement immunogènes tout comme l’est le LPS des autres bactéries. Mais contrairement aux autres bactéries, cette structure complexe confère, à M.avium, une résistance spéciale. Le réseau formé par la membrane, basé sur des hydrocarbonés parallèles, rend la mycobactérie imperméable à de nombreux agents comme l’éthanol, les détergents ou les antibiotiques classiques.

La paroi de notre vecteur tissulaire et sa faculté de synthétiser des perturbateurs de transduction cellulaire permettent à ce dernier d’être l’un des seuls vecteurs résistants au système immunitaire. Ceci est surement l’un des atouts les plus importants du DVS.

Les tissus cibles du DVS [6,7]

Le DVS peut s’attaquer à certaines physiopathologies en fonction des tropismes de son vecteur tissulaire. Ces derniers sont évidemment liés à ceux de M.avium « Wild-type », mais il est envisageable de transformer M.avium pour la rendre sensible à certains chimiotactismes organiques. Pour l’heure, découvrons ce que nous permet M.avium « Wild-type ».

M.avium peut infecter un organisme par voie oral et par voie sanguine. Si sa cousine, M.tuberculosis est souvent vu comme un agent pathogène pulmonaire, les M.avium peuvent potentiellement infecter tous les organes. Cette affirmation est vérifiée chez les patients immunodéprimés au sein desquels la diminution de l’immunité permet à la mycobactérie de se propager dans l’organisme entier.

Des recherches plus poussées sur le tropisme tissulaire ont révélé certains organes cibles. Il a été montré que quelques semaines après l’infection, la concentration de bactérie atteint un plateau dans deux organes : le foie et la rate puis plus tard dans un troisième : les poumons (figure 2).

Figure 2: Invasion des poumons, de la rate, du foie et du thymus par M.avium de 0 à 52 semaines en log de 10 (6 à 10 souris)

On observe également que, durant de nombreuses semaines post-infection, la charge bactérienne continue à augmenter. Or, cette augmentation dans les tissus cibles n’est pas corrélée avec une augmentation de Mycobacterium dans le sang. Cette augmentation est donc le fruit d’une invasion des tissus cibles et non d’une invasion du corps dans son intégralité.
Il y a donc un tropisme mais également une implantation du vecteur dans les tissus cibles. Cette caractéristique est très intéressante car le vecteur n’est pas circulant mais résident.

Notre vecteur possède donc trois tropismes tissulaires intéressants et identifiés. Il peut les cibler, s’y implanter, et s’y développer jusqu’à recevoir le signal de production du vecteur cellulaire.
Le DVS offre ainsi une application thérapeutique sur des physiopathologies touchant les poumons, la rate et le foie.

Système de contrôle du vecteur cellulaire

Notre vecteur tissulaire doit être en mesure de produire notre vecteur cellulaire. Ce dernier étant lytique, il va lyser notre vecteur tissulaire lors de sa libération. Ceci n’est pas un mal en soit, c’est même un avantage, puisqu’il permet de détruire l’agent potentiellement pathogène du DVS. Mais cette lyse ne doit pas s’effectuer n’importe quand. En effet, il faut que le vecteur tissulaire ai le temps de s’implanter dans le tissus cible.

Pour cela, le DVS contient un système de contrôle de lysogénie par la tétracycline, implanté dans le vecteur tissulaire. Ce système est fait de deux éléments :

- un plasmide de synthèse de LacI, contrôlé par la tétracycline,

- un opérateur LacP/O implanté dans le génome du phage et contrôlant ses gènes de lyse.

Le maintient du phage sous sa forme lysogène est induit par l’expression constante du répresseur phagique. Le système est pensé de telle sorte qu’en présence de tétracycline, l’expression du répresseur phagique est inhibée promouvant le phage sous sa forme lytique.
Ainsi, le premier plasmide code pour le répresseur LacI sous le contrôle du promoteur répressé (pTET). L’activité de pTET, et donc l’expression de LacI, dépend entièrement de la fixation de tétracycline sur le répresseur tetR. Une fois produit, LacI se fixe sur le promoteur LacP/O du second plasmide inhibant l’expression du répresseur phagique.

Le système inductif permet donc le maintient d’un cycle lysogène (non lytique) du vecteur cellulaire à l’intérieur de M.avium sous le contrôle de la tétracycline. Le suivie de la bactérie et la mise en place de moyen statistique pour déterminer la cinétique de propagation est essentielles. L’injection de tétracycline déclenche la phase lytique du vecteur cellulaire qui est ainsi libéré et lisant par la même occasion la bactérie.

En résumé…

…, le DVS possède un vecteur tissulaire ayant les caractéristiques suivantes :

- Faible pathogénicité donc faible toxicité,
- Résistance au système immunitaire et donc faible clairance,
- Ciblage tissulaire donc 1ere spécificité,
- Synthèse contrôlée de phages recombinés.

Ces caractéristiques, spécifiques au DVS, apportent une solution aux problèmes récurrents, de spécificité et d’élimination par le système immunitaire, rencontrés par les vecteurs.

[1] RONALD S. FLANNAGAN, GABRIELA COSÍO, SERGIO GRINSTEIN, Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies, NATURE MICROBIOLOGY REVIEWS, May 2009, Volume 7, p. 355-366.

[2]CLARK B. INDERLIED, CAROL A. KEMPER, LUIZ E. M. BERMUDEZ, The Mycobacterium avium Complex, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, July 1993, p. 266-310.

[3] Nisheeth Agarwal, Gyanu Lamichhane, Radhika Gupta, Scott Nolan & William R. Bishai. Cyclic AMP intoxication of macrophages by a Mycobacterium tuberculosis adenylate cyclase. NATURE LETTER 2009

[4] Hunter, R. L., Jagannath, C. & Actor, J. K. Pathology of postprimary tuberculosis in humans and mice: contradiction of long-held beliefs. TUBERCULOSIS (Edinb.) 87, 267–278 (2007).

[5]Axelrod, S. et al. Delay of phagosome maturation by a mycobacterial lipid is reversed by nitric oxide. CELL. MICROBIOL. 10, 1530–1545 (2008).

[6]Nicole N van der Wel, Donna M Fluitsma, Christopher C Dascher, Michael B Brenner and Peter J Peters1, Subcellular localization of mycobacteria in tissues and detection of lipid antigens in organelles using cryo-techniques for light and electron microscopy, CURRENT OPINION IN MICROBIOLOGY 2005, 8:323–330.

[7]Claudia Nobrega, Pere-Joan Cardona, Susana Roque, Perpe´tua Pinto do O ´, Rui Appelberg, Margarida Correia-Neves, The thymus as a target for mycobacterial infections, J.MICINF. 2007.08.006.

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 == Système de contrôle du vecteur cellulaire ==
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 Notre vecteur tissulaire doit être en mesure de produire notre vecteur cellulaire. Ce dernier étant lytique, il va lyser notre vecteur tissulaire lors de sa libération. Ceci n’est pas un mal en soit, c’est même un avantage, puisqu’il permet de détruire l’agent potentiellement pathogène du DVS. Mais cette lyse ne doit pas s’effectuer n’importe quand. En effet, il faut que le vecteur tissulaire ai le temps de s’implanter dans le tissus cible. <br>
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 - un plasmide de synthèse de LacI, contrôlé par la tétracycline,
 - un opérateur LacP/O implanté dans le génome du phage et contrôlant ses gènes de lyse. <br>
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 Le maintient du phage sous sa forme lysogène est induit par l’expression constante du répresseur phagique. Le système est pensé de telle sorte qu’en présence de tétracycline, l’expression du répresseur phagique est inhibée promouvant le phage sous sa forme lytique. <br>
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 Le système inductif permet donc le maintient d’un cycle lysogène (non lytique) du vecteur cellulaire à l’intérieur de M.avium sous le contrôle de la tétracycline. Le suivie de la bactérie et la mise en place de moyen statistique pour déterminer la cinétique de propagation est essentielles. L’injection de tétracycline déclenche la phase lytique du vecteur cellulaire qui est ainsi libéré et lisant par la même occasion la bactérie.<br>
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Team:SupBiotech-Paris/Concept1Fr