Team:SupBiotech-Paris/Ciblage Cellulaire

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Contents

Mise en application du plasmide thérapeutique sur le cancer du poumon

Contexte

Dans le cancer du poumon non à petites cellules, ou NSCLC, comme dans tous cancers, la perte de la capacité apoptotique des cellules tumorales est du à la perte fonctionnelle de divers suppresseurs de tumeur entrant dans la voie de signalisation de la cascade apoptotique.

L’application du DVS dans la lutte anti-cancer repose sur le fait de réactiver cette cascade apoptotique en apportant au sein des cellules tumorales une version wild-type des gènes codant les suppresseurs de tumeur non-fonctionnels.

C’est le [http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/ projet COSMIC] de [http://www.sanger.ac.uk/ l’institut Sanger] qui nous a permis de déterminer quels gènes apporter au plasmide thérapeutique dans le cadre du cancer du poumon à non petites cellules. Ce projet répertorie en effet toutes les mutations détectées pour chaque type de cancers suivant leur fréquence d’apparition. Ainsi, d’après leurs données, la perte de la capacité apoptotique des cellules tumorales pour un cancer du poumon peut être du à la perte fonctionnelle des protéines issus des gènes suivant :


Gènes mutés.jpeg


Ces différents gènes, jouant un rôle prépondérant dans la mise en place du processus apoptotique et étant les plus susceptibles d’avoir mutés dans le cadre d’un cancer du poumon, compose le plasmide thérapeutique.

L’objectif

L’objectif de cette étude est de vérifier si le fait d’amener une version wild-type d’un gène suppresseur de tumeur au sein d’une cellule tumorale pour qui sa version est mutée, induit ou pas le phénomène d’apoptose.

Démarche expérimentale

Lignée cancéreuse et gène apporté

Nous avons sélectionné parmi les lignées cellulaires qui étaient à notre disposition, une lignée cancéreuse dont l’origine cancéreux était du à la mutation d’un gène suppresseur de tumeur. La version wild-type du gène TP53 étant en notre possession, c’est la lignée cancéreuse prostatique p53 muté DU-145 qui retint notre attention.
Nous allons donc tester si le fait d’amener une version wild-type de la protéine p53 (p53wt) au sein de la lignée DU-145 permet le déclenchement du processus d’apoptose.


Protocole de mise en culture :

  1. Sortir l’ampoule de l’azote liquide
  2. Placer l’ampoule dans un bain-marie à 37°C pendant 5 minutes
  3. Dans un falcon 50 ml, mettre 9 ml de MEM 10% + 1 ml d’ampoule
  4. Centrifuger 5 min à 1200 rpm
  5. Aspirer le surnageant sans toucher aux cellules culotées (élimination du DMSO)
  6. Resuspendre le culot dans 1 ml de milieu
  7. Déposer le tout dans une nouvelle flasque T25 contenant 5 ml de milieu
  8. Incubation à 37°C
  9. Ne pas oublier de changer le milieu le lendemain pour éliminer les traces de DMSO
  10. Après une semaine, les cellules sont à confluence 100%

Incorporation du gène TP53

L’incorporation du plasmide contenant p53wt, pcDNA3 CMV+p53wt, au sein des cellules DU-145 s’est effectuée par électroporation.


Matériel :

  • Cellules DU-145
  • Plasmide pcDNA3 CMV+p53wt
  • Milieu de culture électrocompétent
  • Trypsine
  • PBS
  • Bac à glace
  • Cuvette d’électrotransfert
  • Centrifugeuse
  • Incubateur
  • Electroporateur (cliniporateur)


Protocole:

  1. Aspirer le milieu du T25 contant les DU-145
  2. Rincer au PBS
  3. Déposer 500 µl de trypsine et laisser agir 3 minutes à température ambiante
  4. Ajouter 5 ml de MEM 10% pour neutraliser la trypsine
  5. Suspendre les cellules
  6. Récupérer le milieu contenant les DU-145 dans un tube et centrifuger à 1000rpm pendant 10 minutes
  7. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans Xµl (X= 90µl x Nombre de cuves) de milieu électrocompétent (environ 5x105 cellules par cuves)
  8. Suspendre votre solution d’ADN dans du milieu électrocompétent (18x10-2g/L)
  9. Ajouter 10µl de solution d’ADN par cuve
  10. Ajouter 90µl de la suspension cellulaire
  11. Mettre les cuves dans la glace
  12. Passer les cuves à l’électroporateur (cliniporateur) et enregistrer chaque résultat
  13. Incuber les cuves à 37°C pendant 30 minutes
  14. Mettre le contenu de chaque cuve dans un tube stérile, ajouter 3ml de milieu de culture MEM 10%, puis incuber à 37°C pendant le temps nécessaire (jusqu’au test à l’annexine V)


Détection de l’apoptose

La détection des cellules apoptotiques s’est effectuée par le test à l’annexine V :

En phase précoce de l’apoptose, on observe la translocation de la phosphatidyl-sérine à l’extérieur de la membrane plasmique. Celle-ci est mise en évidence par fixation spécifique de l'annexine V couplée à un fluorophore et analysée par cytométrie en flux.


Matériel :

  • Iodure de propidium 1 mg/ml In vitrogen conservé au frigidaire à diluer 10 fois
  • Annexine V
  • Tampon annexine


Travailler le plus possible dans l’obscurité (fluorophore photolabile)


Protocole :

  1. Récupérer le milieu de culture (3 ml), le déposer dans un falcon 50 ml
  2. Rincer la culture avec 3 ml de PBS, les déposer dans le falcon
  3. Décoller les cellules à la trypsine, les déposer dans le falcon
  4. Centrifuger
  5. Reprendre le culot dans 0.5 ou 1 ml de PBS froid en fonction du niveau de confluence
  6. Prélever 10 µl pour un comptage et centrifuger
  7. Re-suspendre le culot dans du tampon annexine à la concentration de 1*106 cellule/ml
  8. Pipetter 2 aliquots de 100 µl dans 2 tubes FACS
  9. Ajouter dans chaque tube 5 µl d’annexine V et 1 µl de iodure de propidium
  10. Incuber 15 min à RT
  11. Arrêter la réaction en plaçant les tubes dans la glace fondante
  12. Ajouter 400 µl de tampon d’annexine V
  13. Lire au FACS le plus rapidement possible en conservant les tubes dans la glace

Déroulement de l’étude

Ne connaissant pas le temps d’expression du plasmide au sein de la lignée DU-145, nous avons réalisé un suivi cinétique de l’induction de l’apoptose en pratiquant un test à l’annexine V toutes les 6 heures pendant 48h après son électroporation. De ce fait, en couplant les taux d’apoptose de la population témoin (électroporation à vide) et de la population test (électroporation avec plasmide) avec leur taux de croissance respectifs, nous serons en mesure de déterminer l’impacte de p53wt sur l’induction de l’apoptose. La population témoin permettant d’éliminer les morts cellulaires dus à l’électroporation et au transfert de culture.

N’ayant pas eu un accès continu au cytomètre en flux, nous avons regroupé l’ensemble des 48h d’analyse en deux runs de cytométrie. Chaque créneau horaire de l’étude est représenté par une population cellulaire distincte. Ainsi nous avons réalisé 14 électroporations correspondant aux 7 créneaux horaires : +6h, +12h, +18h, +24h, +30h, +36h et +48h (deux par créneaux : population test + population témoin).


Voici le planning de répartition des électroporations:


Planning.jpeg


Trois populations cellulaires ont donc été respectivement électroporées 12h, 24h et 36h avant le premier run de cytométrie (en rouge, à 9h, jour 3), quatre autres 6h, 18h, 30h et 48h avant le second run (en vert, à 16h, jour 3).

La première analyse cytométrique nous a permis d’obtenir les données pour le suivi à +12h, +24h et +36h, tandis que la seconde, nous a permis d’obtenir les données pour le suivi à +6h, 18h, +30h et +48h.

En couplant toutes ces données, on obtient un suivi sur 48h de l’induction de l’apoptose après électroporation de p53wt.


Résultats

Chaque population cellulaire représentant les différentes tranches horaires du suivi a subi un test à l’annexine V à l’instant escompté. Malheureusement, une mauvaise dilution du tampon de l’annexine à causé la mort de toutes les populations cellulaires lors du test. Bien que les résultats furent probants pour les suivis à +24h, +30h et +48h par simple comparaison des populations contrôles et testes au microscope (figure 1), nous n’avons pu le confirmer par l’analyse cytométrique.


File:Figure1.jpeg
Figure 1 : morphologie des cellules avec ou sans incorporation de p53 wild-type


N’ayant pu commencer la culture des DU-145 que début octobre, les deux semaines qui nous a fallu pour atteindre la confluence nécessaire à l’expérimentation n’ont pas laissé place à la pratique d’un second essaie…


Cependant, de nombreuses études ont montré que le fait d’amener p53 wild types au sein de cellules tumorales p53 mutés déclenchait le processus d’apoptose [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]. C’est le cas notamment de l’étude menée par Chunlin Yang [1] en 1995 qui a travaillé, tout comme nous, sur des cellules cancéreuses prostatiques p53 mutée (Tsu-pr1). La transfection de p53 wild type n’a pas été réalisée par électroporation mais en infectant les cellules tumorales avec des adénovirus non réplicatifs contenant p53wt (AdCMV.p53). Quarante-huit heures après avoir infecté une population tumorale avec AdCMV.p53, une forte expression de p53 est corrélée avec un taux important de mort cellulaire. Si les populations témoins (cellules non-infectées et cellules infectées avec des adénovirus contenant le gène LacZ, AdCMV.NLSßgal) montrent une morphologie tout à fait similaire et saine, une condensation et un détachement cellulaire est observé chez la population p53 infectées. Afin de vérifier si le processus de mort suivis par ces cellules correspond bien à la voie apoptotique, une migration sur gel d’agarose de leurs génomes a été réalisée.


File:Figure2.jpeg
Figure 2 : électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN isolé de cellules non-infectées (a), infectées par AdCMV.NLSßgal (b) et AdCMV.p53 (c).


Les cellules infectées par AdCMV.p53 montrent une multitude de bandes (laddering pattern) tandis que les cellules non-infectées ou infectées par AdCMV.NLSßgal n’en montrent qu’une seul et unique de haut poids moléculaire. Ces résultats indiquent que la mort cellulaire induite par p53 wild type est d’origine apoptotique avec l’observation de la fragmentation du génome, conséquence de l’activité de la CAD (Caspase Activated DNase), une endonucléase spécifique au processus d’apoptose.

Un teste MTT à permit de quantifier l’effet induit par l’expression de p53 wild type chez les cellules infectées.


File:Figure3.jpeg
Figure 3 : effet de l’AdCMV.p53 sur la survie cellulaire. Les cellules témoins et celles infectées à l’AdCMV.p53 ont été incubé dans du milieu serum-free après 1h d’infection.


En l’absence de sérum, les cellules non-infectées et ßgal infectées continuent de proliférer. En revanche, pour les cellules p53 infectées, la prolifération est stoppée et suivis d’une importante chute de la population. Après 72h, la quasi-totalité des cellules p53 infectées sont mortes (figure 3).


Selon cette étude, il apparait clairement que le fait d’amener une version wild-type de la p53 au sein d’une population cellulaire p53 mutée induit le phénomène d’apoptose et réduit de manière significative la population tumorale.


Des résultats similaires ont été rapportés par l’étude menée par Corrado Cirielli (en 1999) mais portant cette fois-ci sur la lignée cancéreuse U251 issue d’un gliome. Les mêmes types d’analyses que celles réalisées au cours de l’étude précédente ont été pratiquées.


Analyse morphologique des cellules infectées par AdCMV.p53 (a), non-infectées (b) ou infectées par AdCMV.NULL (c) :


File:Figure4.jpeg
Figure 4 : morphologie des cellules infectées par AdCMV.p53 (a), non-infectées (b) ou infectées par AdCMV.NULL (c), une semaine après infection.


Les populations témoins (b et c) prolifèrent et forment un tapis cellulaire une semaine après le début de l’expérience tandis que la population teste (a) montrent très peu de cellules adhérentes (perte cellulaire importante) et un changement morphologique conséquent : les cellules sont sphériques.


Effet de l’AdCMV.p53 sur la fragmentation de l’ADN :


File:Figrue5.jpeg
Figure 5 : électrophorèse sur gel d’agarose d’ADN isolé de cellules non-infectées, infectées par AdCMV.NULL et AdCMV.p53.


Après infection à l’AdCMV.p53, les cellules U-251 montre une fragmentation de leurs génomes caractéristique du processus d’apoptose.


Suivie de la prolifération des cellules non-infectées et des cellules infectées par AdCMV.p53 ou AdCMV.NULL par un teste MTT :


File:Figure6.jpeg
Figure 6 : prolifération des populations témoins (non-infectées ou AdCMV.NULL infectées) et de la population teste par suivie de la densité optique après un teste MTT.


Les cellules non-infectées et celles infectées par AdCMV.NULL prolifèrent de manière significative au cours de la semaine d’analyse tandis que les cellules infectées par AdCMV.p53 présentent une absence total de prolifération et diminution continue de leur population.


Cette étude montre une nouvelle fois que le fait d’amener une version wild-type de la p53 au sein d’une population cellulaire p53 mutée induit la mort cellulaire par apoptose.


Conclusion

Bien que nous n’ayons pu en apporter la preuve par nos propres moyens, de nombreuses études montrent qu’amener une version wild-type d’un gène suppresseur de tumeur au sein d’une cellule tumorale muté pour ce gène permet le déclenchement du processus d’apoptose conduisant à une régression significative voir total de la population tumorale.

Des études in vivo chez l’homme ont d’ores et déjà été menées et présentent des résultats probants.



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