Team:Paris/ProtocolsA

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Utilisation du microscope a fluo (à mettre en anglais et en plus beau)
 
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I: CULTURE DES BACTERIES
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==Protocols suggested==
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<p>A : Culture de bactérie (choisir des couleurs différents (GFP+YFP pas compatible car jaune et vert trop proche)</p>
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<html>
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<p>A  (bis): Coloration de la membrane des bactéries avec du DID si on veut se référer au protocole.</p>
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<style type="text/css">
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#left-side {
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    background: url(https://static.igem.org/mediawiki/2009/4/40/Right_menu_paris.png);
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    z-index:4;
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}
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II: PREPARATION DE LA LAME  (au moins quelque heure à l'avance, ou le mieux c'est la veille: pour que la lame soit sèche, sinon les bactéries pataugent)
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a.menu_sub {
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    padding-left: 7px;
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    padding-right: 7px;
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}
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<p>1: Nettoyer la lame de verre</p>
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a.menu_sub_active {
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<p>2: On colle la fenêtre dessus (carré ou rectangle bleu)</p>
+
    padding-left: 7px;
-
<p>3: Préparer le milieu s’il n'est encore fait : 1,5% Agarose+ le milieu (LB)</p>  
+
    padding-right: 7px;
-
<p>4: Faire chauffer en microonde le milieu préparé</p>
+
    color:#b0310e;
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<p>5: 50 µL du milieu agarose, et le mettre au milieu du carré collé sur la lame.</p>
+
    font-weight:bold;
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<p>6: Superposer une deuxième lame par dessus, sans faire de bulle  en appuyant sur la bordure bleu du carré (et pas au milieu du carré (pendant 30 seconde)</p>
+
}
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<p>7: Mettre au frigo 10 minutes </p>
+
</style>
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<div id="left-side"></div>
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<div id="middle-side"><center>
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<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/Protocols#bottom"> Main </a>|
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<a class="menu_sub_active" href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsA#bottom"> Microscope Protocols</a>|
 +
<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsB#bottom"> Adapted Protocols</a>|
 +
<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/Protocols_Culture#bottom"> Culture Protocols</a>|
 +
<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsMB#bottom"> Molecular biology</a>
 +
</center>
 +
</div>
-
III: PREPARATION DES CELLULES À OBSERVER
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<div id="right-side"></div>
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<p>1-Resuspendre les bactéries prélevées dans un ependorff dans 1 ml de son milieu (LB)</p>
+
</html>
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<p>2-Vortexer pas trop sinon ça tue les cellules.</p>
+
===Bacteria culture===
-
+
# Chose different colors beware incompatibility with GFP+YFP (green and yellow to close)
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# Membrane bacteria coloraiton with DID
-
IV: PREPARATION DE LA LAME A OBSERVER
 
-
<p>1: Ressortir la lame du frigo </p>
 
-
<p>2: Enlever la lame du dessus (en la glissant)</p>
 
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<p>3: Couper l'agarose dépassant du carré</p>
 
-
<p>4: Découper en plusieurs morceaux l'agarose, si on veut faire plusieurs observations différentes en même temps.</p>
 
-
<p>5: Poser les cellules sur le gel d'agarose (environ 1 microlitre de la suspension cellulaire (pas de risque de débordement sur le gel))</p>
 
-
<p>6: Sécher la lame en agitant dans l'air </p>
 
-
<p>7: Poser une lamelle sur la lame (attention bulle poser la lame d’un côté et la laisser tomber)</p>
 
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===Blade preparation===
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(do this step a few hours before; the blade need to be dry)
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# Clean the glass blade
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# Put the small blade on it (the blue square)
 +
# Prepare the 1,5% Agarose + LB, boil it (microwave), let it cooling down
 +
# take 50 µL agarose, put it in the middle of the blue square on the blade.
 +
# put on it another blade, beware do not make bubbles, press it until 30sec
 +
# 10min at 4°C
 +
 +
===Cells preparation===
 +
# Resuspend bactéria in 1mL LB in an ependorff tube
 +
# Quick centrifugation (low RPM)
 +
 +
 +
===Blade===
 +
# Take back the blade from the fridge
 +
# Pull off the upper blade (slide it)
 +
# Cut exceeded Agarose (if we want multiple observation, cut few Agarose)
 +
# Put cells on the agarose gel (1µL)
 +
# dry it with air agitation
 +
# put a little blade on the bigger one, beware of bubbles
 +
 +
=== Microscopy observation===
-
V: OBSERVATION AU MICROSCOPE
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# power on the computer (what a nice idear)
 +
# light up the 4 switch starting from the right one
 +
# light up the green one
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# stay at 37°C
 +
# use MetaMorph sotware
 +
# put the blade
 +
# adjuste (use oil if you use x100)
 +
# choose "Trans No Filter" (white light)
 +
# use Acquire->Acquire->More
 +
# take care of camera temperature (need to stay at -30°C
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# Show live (if no image verify the display position)
 +
# Setting Modified (exposition settings)
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## if " Trans No Filter" (at the begining): put "100 ms trans on"
 +
## if filter (CFP, GFP, etc...): put "1s fluo at"
 +
## if it's not lean yet: put "4s fluo at"
 +
##Beware we didn't have all the filter (GFP for example). If we want the RFP filter, we need to take the last one...
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# >Acquire for picture or >Show live
 +
# When it's done
 +
## Slide up the camera
 +
## Use the joystick to take out the blade
 +
## Clean the camera with kodak paper
 +
## wait 30min for the 1st switch starting from the left
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<p>1: Allumer l'ordinateur (s’il n’est pas allumé)</p>
 
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<p>2: Allumer les 4 switchs sur les étagères (de droite à gauche !!!!)</p>
 
-
<p>3: Allumer sur la tranche du microscope le bouton vert</p>
 
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<p>4: Allumer le climatiseur (module tout en haut, pour maintenir la cage à 37°) (s’il n’est pas allumer)</p>
 
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<p>5: Lancer le logiciel MetaMorph</p>
 
-
<p>6: Placer la lame sous le microscope dans l'emplacement réservé</p>
 
-
<p>7: Manipuler le joystick pour mettre la lame en dessus de l'objectif</p>
 
-
<p>8: Si on utilise le x100, mettre une goutte d'huile sur la lame.</p>
 
-
<p>9: Mise au point:</p>
 
-
_Choisir "Trans No Filter" (lumière blanche)</p>
 
-
<p>10: Bouger la tirette pour avoir la vision caméra ou occulaire.</p>
 
-
<p>11: Sélectionner l’onglet Acquire->Acquire->More</p>
 
-
 
-
<p>12: Vérifier que la température de la caméra est à environ - 30°C (voyant vert quand tout se passe bien)</p>
 
-
<p>13: Show live (pour voir ce qui se passe en direct à la caméra</p>
 
-
Si aucune image ne se forme (vérifier que la tirette est tiré en position "écran")
 
-
<p>14: Setting Modified (pour régler le temps d'exposition)</p>
 
-
<p>Si " Trans No Filter" (au début): mettre "100 ms trans on"</p>
 
-
<p>Si on utilise un filtre (CFP, GFP, etc...):mettre "1s fluo at"</p>
 
-
<p>Mais si ce n’est pas encore très claire (le mettre "4s fluo at")</p>
 
-
<p>Attention: On n’a pas tout les filtres (en particulier GFP)</p>
 
-
<p>Si on veut utiliser le filtre RFP, il faut prendre le dernier et pas l'avant dernier</p>
 
-
<p>15: Cliquer sur Acquire pour prendre la photo ou sur Show live pour la vision direct de la caméra</p>
+
===Time laps variant===
-
<p>16: Quand on a fini :
+
# >Journal/edit journal
-
<p>Remonter l'objectif</p>
+
# >igem/journal/TLPS_phase.JNL
-
<p>Utiliser le joystick pour sortir la lame</p>
+
# Choose in the TEST file, edit filter, positions, time etc....
-
<p>Sur l'objectif passer un coup de papier kodak (à celle mise en contact avec l'huile)</p>
+
# Run journal on TEST, >stop
-
<p>Pour Eteindre, il faut attendre 30 minute pour le premier switch (en partant de la gauche et eteindre de gauche à droite (inverse du sens d'allumage...) (sinon laisser allumer))</p>
+

Latest revision as of 15:08, 19 October 2009

iGEM > Paris > Protocols > Microscope Protocol


Contents

Protocols suggested

Bacteria culture

  1. Chose different colors beware incompatibility with GFP+YFP (green and yellow to close)
  2. Membrane bacteria coloraiton with DID


Blade preparation

(do this step a few hours before; the blade need to be dry)

  1. Clean the glass blade
  2. Put the small blade on it (the blue square)
  3. Prepare the 1,5% Agarose + LB, boil it (microwave), let it cooling down
  4. take 50 µL agarose, put it in the middle of the blue square on the blade.
  5. put on it another blade, beware do not make bubbles, press it until 30sec
  6. 10min at 4°C

Cells preparation

  1. Resuspend bactéria in 1mL LB in an ependorff tube
  2. Quick centrifugation (low RPM)


Blade

  1. Take back the blade from the fridge
  2. Pull off the upper blade (slide it)
  3. Cut exceeded Agarose (if we want multiple observation, cut few Agarose)
  4. Put cells on the agarose gel (1µL)
  5. dry it with air agitation
  6. put a little blade on the bigger one, beware of bubbles

Microscopy observation

  1. power on the computer (what a nice idear)
  2. light up the 4 switch starting from the right one
  3. light up the green one
  4. stay at 37°C
  5. use MetaMorph sotware
  6. put the blade
  7. adjuste (use oil if you use x100)
  8. choose "Trans No Filter" (white light)
  9. use Acquire->Acquire->More
  10. take care of camera temperature (need to stay at -30°C
  11. Show live (if no image verify the display position)
  12. Setting Modified (exposition settings)
    1. if " Trans No Filter" (at the begining): put "100 ms trans on"
    2. if filter (CFP, GFP, etc...): put "1s fluo at"
    3. if it's not lean yet: put "4s fluo at"
    4. Beware we didn't have all the filter (GFP for example). If we want the RFP filter, we need to take the last one...
  13. >Acquire for picture or >Show live
  14. When it's done
    1. Slide up the camera
    2. Use the joystick to take out the blade
    3. Clean the camera with kodak paper
    4. wait 30min for the 1st switch starting from the left


Time laps variant

  1. >Journal/edit journal
  2. >igem/journal/TLPS_phase.JNL
  3. Choose in the TEST file, edit filter, positions, time etc....
  4. Run journal on TEST, >stop

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