Team:Paris/ProtocolsA

From 2009.igem.org

(Difference between revisions)
(→B. Protocols suggested)
(→Protocols suggested)
Line 10: Line 10:
</html>
</html>
-
===Protocols suggested===
+
==Protocols suggested==
-
Utilisation du microscope a fluo (à mettre en anglais et en plus beau)
+
===Bacteria culture===
 +
# Chose different colors beware incompatibility with GFP+YFP (green and yellow to close)
 +
# Membrane bacteria coloraiton with DID
-
I: CULTURE DES BACTERIES
 
-
<p>A : Culture de bactérie (choisir des couleurs différents (GFP+YFP pas compatible car jaune et vert trop proche)</p>
 
-
<p>A  (bis): Coloration de la membrane des bactéries avec du DID si on veut se référer au protocole.</p>
 
 +
===Blade preparation===
 +
(do this step a few hours before; the blade need to be dry)
-
II: PREPARATION DE LA LAME  (au moins quelque heure à l'avance, ou le mieux c'est la veille: pour que la lame soit sèche, sinon les bactéries pataugent)
+
# Clean the glass blade
 +
# Put the small blade on it (the blue square)
 +
# Prepare the 1,5% Agarose + LB, boil it (microwave), let it cooling down
 +
# take 50 µL agarose, put it in the middle of the blue square on the blade.
 +
# put on it another blade, beware do not make bubbles, press it until 30sec
 +
# 10min at 4°C
-
<p>1: Nettoyer la lame de verre</p>
+
===Cells preparation===
-
<p>2: On colle la fenêtre dessus (carré ou rectangle bleu)</p>
+
# Resuspend bactéria in 1mL LB in an ependorff tube
-
<p>3: Préparer le milieu s’il n'est encore fait : 1,5% Agarose+ le milieu (LB)</p>
+
# Quick centrifugation (low RPM)
-
<p>4: Faire chauffer en microonde le milieu préparé</p>
+
-
<p>5: 50 µL du milieu agarose, et le mettre au milieu du carré collé sur la lame.</p>
+
-
<p>6: Superposer une deuxième lame par dessus, sans faire de bulle  en appuyant sur la bordure bleu du carré (et pas au milieu du carré (pendant 30 seconde)</p>
+
-
<p>7: Mettre au frigo 10 minutes </p>
+
-
 
+
-
III: PREPARATION DES CELLULES À OBSERVER
+
-
 
+
-
<p>1-Resuspendre les bactéries prélevées dans un ependorff dans 1 ml de son milieu (LB)</p>
+
-
<p>2-Vortexer pas trop sinon ça tue les cellules.</p>
+
-
IV: PREPARATION DE LA LAME A OBSERVER
+
===Blade===
-
 
+
# Take back the blade from the fridge
-
<p>1: Ressortir la lame du frigo </p>
+
# Pull off the upper blade (slide it)
-
<p>2: Enlever la lame du dessus (en la glissant)</p>
+
# Cut exceeded Agarose (if we want multiple observation, cut few Agarose)
-
<p>3: Couper l'agarose dépassant du carré</p>
+
# Put cells on the agarose gel (1µL)
-
<p>4: Découper en plusieurs morceaux l'agarose, si on veut faire plusieurs observations différentes en même temps.</p>
+
# dry it with air agitation
-
<p>5: Poser les cellules sur le gel d'agarose (environ 1 microlitre de la suspension cellulaire (pas de risque de débordement sur le gel))</p>
+
# put a little blade on the bigger one, beware of bubbles
-
<p>6: Sécher la lame en agitant dans l'air </p>
+
-
<p>7: Poser une lamelle sur la lame (attention bulle poser la lame d’un côté et la laisser tomber)</p>
+
-
 
+
-
 
+
-
V: OBSERVATION AU MICROSCOPE
+
-
 
+
-
<p>1: Allumer l'ordinateur (s’il n’est pas allumé)</p>
+
-
<p>2: Allumer les 4 switchs sur les étagères (de droite à gauche !!!!)</p>
+
-
<p>3: Allumer sur la tranche du microscope le bouton vert</p>
+
-
<p>4: Allumer le climatiseur (module tout en haut, pour maintenir la cage à 37°) (s’il n’est pas allumer)</p>
+
-
<p>5: Lancer le logiciel MetaMorph</p>
+
-
<p>6: Placer la lame sous le microscope dans l'emplacement réservé</p>
+
-
<p>7: Manipuler le joystick pour mettre la lame en dessus de l'objectif</p>
+
-
<p>8: Si on utilise le x100, mettre une goutte d'huile sur la lame.</p>
+
-
<p>9: Mise au point:</p>
+
-
_Choisir "Trans No Filter" (lumière blanche)</p>
+
-
<p>10: Bouger la tirette pour avoir la vision caméra ou occulaire.</p>
+
-
<p>11: Sélectionner l’onglet Acquire->Acquire->More</p>
+
-
+
-
<p>12: Vérifier que la température de la caméra est à environ - 30°C (voyant vert quand tout se passe bien)</p>
+
-
<p>13: Show live (pour voir ce qui se passe en direct à la caméra</p>
+
-
Si aucune image ne se forme (vérifier que la tirette est tiré en position "écran")
+
-
<p>14: Setting Modified (pour régler le temps d'exposition)</p>
+
-
<p>Si " Trans No Filter" (au début): mettre "100 ms trans on"</p>
+
-
<p>Si on utilise un filtre (CFP, GFP, etc...):mettre "1s fluo at"</p>
+
-
<p>Mais si ce n’est pas encore très claire (le mettre "4s fluo at")</p>
+
-
<p>Attention: On n’a pas tout les filtres (en particulier GFP)</p>
+
-
<p>Si on veut utiliser le filtre RFP, il faut prendre le dernier et pas l'avant dernier</p>
+
-
 
+
-
<p>15: Cliquer sur Acquire pour prendre la photo ou sur Show live pour la vision direct de la caméra</p>
+
-
 
+
-
<p>16: Quand on a fini :
+
-
<p>Remonter l'objectif</p>
+
-
<p>Utiliser le joystick pour sortir la lame</p>
+
-
<p>Sur l'objectif passer un coup de papier kodak (à celle mise en contact avec l'huile)</p>
+
-
<p>Pour Eteindre, il faut attendre 30 minute pour le premier switch (en partant de la gauche et eteindre de gauche à droite (inverse du sens d'allumage...) (sinon laisser allumer))</p>
+
-
 
+
-
VI: Variante time laps
+
=== Microscopy observation===
-
Journal/edit journal
+
# power on the computer (what a nice idear)
 +
# light up the 4 switch starting from the right one
 +
# light up the green one
 +
# stay at 37°C
 +
# use MetaMorph sotware
 +
# put the blade
 +
# adjuste (use oil if you use x100)
 +
# choose "Trans No Filter" (white light)
 +
# use Acquire->Acquire->More
 +
# take care of camera temperature (need to stay at -30°C
 +
# Show live (if no image verify the display position)
 +
# Setting Modified (exposition settings)
 +
## if " Trans No Filter" (at the begining): put "100 ms trans on"
 +
## if filter (CFP, GFP, etc...): put "1s fluo at"
 +
## if it's not lean yet: put "4s fluo at"
 +
##Beware we didn't have all the filter (GFP for example). If we want the RFP filter, we need to take the last one...
 +
# >Acquire for picture or >Show live
 +
# When it's done
 +
## Slide up the camera
 +
## Use the joystick to take out the blade
 +
## Clean the camera with kodak paper
 +
## wait 30min for the 1st switch starting from the left
-
dossier igem/journal/TLPS_phase.JNL
 
-
choisir dans le menu le fichier TEST et eventuellement éditer les temps de prise de vue, les filtres, choisir les positions....
+
===Time laps variant===
-
run journal sur la page test. stop pour arreter en cours de route.
+
# >Journal/edit journal
 +
# >igem/journal/TLPS_phase.JNL
 +
# Choose in the TEST file, edit filter, positions, time etc....
 +
# Run journal on TEST, >stop

Revision as of 12:24, 10 August 2009

Contents

Protocols

Main - Microscopy Protocol - Adapted Protocols - Culture - Molecular Biology

Protocols suggested

Bacteria culture

  1. Chose different colors beware incompatibility with GFP+YFP (green and yellow to close)
  2. Membrane bacteria coloraiton with DID


Blade preparation

(do this step a few hours before; the blade need to be dry)

  1. Clean the glass blade
  2. Put the small blade on it (the blue square)
  3. Prepare the 1,5% Agarose + LB, boil it (microwave), let it cooling down
  4. take 50 µL agarose, put it in the middle of the blue square on the blade.
  5. put on it another blade, beware do not make bubbles, press it until 30sec
  6. 10min at 4°C

Cells preparation

  1. Resuspend bactéria in 1mL LB in an ependorff tube
  2. Quick centrifugation (low RPM)


Blade

  1. Take back the blade from the fridge
  2. Pull off the upper blade (slide it)
  3. Cut exceeded Agarose (if we want multiple observation, cut few Agarose)
  4. Put cells on the agarose gel (1µL)
  5. dry it with air agitation
  6. put a little blade on the bigger one, beware of bubbles

Microscopy observation

  1. power on the computer (what a nice idear)
  2. light up the 4 switch starting from the right one
  3. light up the green one
  4. stay at 37°C
  5. use MetaMorph sotware
  6. put the blade
  7. adjuste (use oil if you use x100)
  8. choose "Trans No Filter" (white light)
  9. use Acquire->Acquire->More
  10. take care of camera temperature (need to stay at -30°C
  11. Show live (if no image verify the display position)
  12. Setting Modified (exposition settings)
    1. if " Trans No Filter" (at the begining): put "100 ms trans on"
    2. if filter (CFP, GFP, etc...): put "1s fluo at"
    3. if it's not lean yet: put "4s fluo at"
    4. Beware we didn't have all the filter (GFP for example). If we want the RFP filter, we need to take the last one...
  13. >Acquire for picture or >Show live
  14. When it's done
    1. Slide up the camera
    2. Use the joystick to take out the blade
    3. Clean the camera with kodak paper
    4. wait 30min for the 1st switch starting from the left


Time laps variant

  1. >Journal/edit journal
  2. >igem/journal/TLPS_phase.JNL
  3. Choose in the TEST file, edit filter, positions, time etc....
  4. Run journal on TEST, >stop

Retrieved from "http://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsA"