Team:Paris/Protocols

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{{Template:Paris2009}}
{{Template:Paris2009}}
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{{Template:Paris2009_menu}}
-
== Protocols ==
 
-
Here you will find the collection of protocole we use, or just collect. And because we are well-known chauvinist it is just a tribute to previous Paris iGEM team .
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==Main==
-
We try our best not to make it redondant.
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<html>
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<style type="text/css">
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#left-side {
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----
+
#right-side {
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'''iGEM paris 2009 protocols link :'''
+
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+
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 +
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<div id="left-side"></div>
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<div id="middle-side"><center>
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<a class="menu_sub_active"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/Protocols#bottom"> Main </a>|
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<a class="menu_sub" href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsA#bottom"> Microscope Protocols</a>|
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<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsB#bottom"> Adapted Protocols</a>|
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<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/Protocols_Culture#bottom"> Culture Protocols</a>|
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<a class="menu_sub"href="https://2009.igem.org/Team:Paris/ProtocolsMB#bottom"> Molecular biology</a>
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</center>
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</div>
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<u>our protocol:</u>
+
<div id="right-side"></div>
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*[[Team:Paris/Protocols_Competent_Bacteria | Protocol to make competent bacteria]]
 
-
*[[Team:Paris/Protocols_PCRqload | Protocole PCR quick load Taq mix]]
 
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*[http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp00282.pdf Protocol to membrane dying, DID method]
 
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'''iGEM paris 2008 protocols link :'''
 
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[https://2008.igem.org/Team:Paris/Notebook/Protocols Click here]
 
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-
<u>content :</u>
 
-
 
-
*Electrophoresis
 
-
*Concentration of the Miniprep or the Midiprep
 
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*Amplification of promoters.
 
-
*PCR Screening
 
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*Protocol to make competent bacteria
 
-
 
-
 
-
 
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----
 
-
'''iGEM paris 2007 protocols link :'''
 
-
 
-
----
 
-
 
-
 
-
[http://parts.mit.edu/igem07/index.php/Paris/PROTOCOLS Click here]
 
-
 
-
 
-
<u>content :</u>
 
-
 
-
*Growing_bacteria_in_liquid_medium
 
-
*Preparing growth media
 
-
**exemple: Making 10 petri dish (LB+erythromycin+citrate+DAP), Solid M9 Minimum Medium, preparation of agarosis gel
 
-
*Chemical transformation
 
-
*Glycerol Stock
 
-
*Recombineering/Lambda red-mediated gene replacement
 
-
*Miniprep
 
-
*Fluorescent single cells visualisation
 
-
*Digestion reactions
 
-
 
-
 
-
<html>
 
-
</div>
 
-
<div id="paris_content_boxtop">
 
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</div>
 
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<div id="paris_content">
 
</html>
</html>
-
== Protocols suggested ==
+
===1. Microscopy===
-
 
+
* [[Team:Paris/ProtocolsA#Protocols suggested | Protocols suggested]]
-
 
+
*[http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp00282.pdf Protocol to membrane dying, DID method (pdf)]
-
Utilisation du microscope a fluo (à mettre en anglais et en plus beau)
+
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+
-
 
+
-
 
+
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I: CULTURE DES BACTERIES
+
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<p>A : Culture de bactérie (choisir des couleurs différents (GFP+YFP pas compatible car jaune et vert trop proche)</p>
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<p>A  (bis): Coloration de la membrane des bactéries avec du DID si on veut se référer au protocole.</p>
+
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+
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+
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II: PREPARATION DE LA LAME  (au moins quelque heure à l'avance, ou le mieux c'est la veille: pour que la lame soit sèche, sinon les bactéries pataugent)
+
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+
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<p>1: Nettoyer la lame de verre</p>
+
-
<p>2: On colle la fenêtre dessus (carré ou rectangle bleu)</p>
+
-
<p>3: Préparer le milieu s’il n'est encore fait : 1,5% Agarose+ le milieu (LB)</p>
+
-
<p>4: Faire chauffer en microonde le milieu préparé</p>
+
-
<p>5: 50 µL du milieu agarose, et le mettre au milieu du carré collé sur la lame.</p>
+
-
<p>6: Superposer une deuxième lame par dessus, sans faire de bulle  en appuyant sur la bordure bleu du carré (et pas au milieu du carré (pendant 30 seconde)</p>
+
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<p>7: Mettre au frigo 10 minutes </p>
+
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+
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III: PREPARATION DES CELLULES À OBSERVER
+
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<p>1-Resuspendre les bactéries prélevées dans un ependorff dans 1 ml de son milieu (LB)</p>
+
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<p>2-Vortexer pas trop sinon ça tue les cellules.</p>
+
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+
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+
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IV: PREPARATION DE LA LAME A OBSERVER
+
-
 
+
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<p>1: Ressortir la lame du frigo </p>
+
-
<p>2: Enlever la lame du dessus (en la glissant)</p>
+
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<p>3: Couper l'agarose dépassant du carré</p>
+
-
<p>4: Découper en plusieurs morceaux l'agarose, si on veut faire plusieurs observations différentes en même temps.</p>
+
-
<p>5: Poser les cellules sur le gel d'agarose (environ 1 microlitre de la suspension cellulaire (pas de risque de débordement sur le gel))</p>
+
-
<p>6: Sécher la lame en agitant dans l'air </p>
+
-
<p>7: Poser une lamelle sur la lame (attention bulle poser la lame d’un côté et la laisser tomber)</p>
+
-
 
+
-
 
+
-
V: OBSERVATION AU MICROSCOPE
+
-
<p>1: Allumer l'ordinateur (s’il n’est pas allumé)</p>
+
===2. Adapted Protocols===
-
<p>2: Allumer les 4 switchs sur les étagères (de droite à gauche !!!!)</p>
+
* DNA extraction
-
<p>3: Allumer sur la tranche du microscope le bouton vert</p>
+
* [[Team:Paris/ProtocolsB#Adaptation of PureYield&trade; Plasmid Miniprep System (Promega) |Mini prep ]]
-
<p>4: Allumer le climatiseur (module tout en haut, pour maintenir la cage à 37°) (s’il n’est pas allumer)</p>
+
*  Gel/PCR Purification
-
<p>5: Lancer le logiciel MetaMorph</p>
+
-
<p>6: Placer la lame sous le microscope dans l'emplacement réservé</p>
+
-
<p>7: Manipuler le joystick pour mettre la lame en dessus de l'objectif</p>
+
-
<p>8: Si on utilise le x100, mettre une goutte d'huile sur la lame.</p>
+
-
<p>9: Mise au point:</p>
+
-
_Choisir "Trans No Filter" (lumière blanche)</p>
+
-
<p>10: Bouger la tirette pour avoir la vision caméra ou occulaire.</p>
+
-
<p>11: Sélectionner l’onglet Acquire->Acquire->More</p>
+
-
+
-
<p>12: Vérifier que la température de la caméra est à environ - 30°C (voyant vert quand tout se passe bien)</p>
+
-
<p>13: Show live (pour voir ce qui se passe en direct à la caméra</p>
+
-
Si aucune image ne se forme (vérifier que la tirette est tiré en position "écran")
+
-
<p>14: Setting Modified (pour régler le temps d'exposition)</p>
+
-
<p>Si " Trans No Filter" (au début): mettre "100 ms trans on"</p>
+
-
<p>Si on utilise un filtre (CFP, GFP, etc...):mettre "1s fluo at"</p>
+
-
<p>Mais si ce n’est pas encore très claire (le mettre "4s fluo at")</p>
+
-
<p>Attention: On n’a pas tout les filtres (en particulier GFP)</p>
+
-
<p>Si on veut utiliser le filtre RFP, il faut prendre le dernier et pas l'avant dernier</p>
+
-
<p>15: Cliquer sur Acquire pour prendre la photo ou sur Show live pour la vision direct de la caméra</p>
+
===3. Culture protocols===
 +
* Over Night
 +
*[[Team:Paris/Protocols_Culture#Bacterial transformation | Bacterial transformation]]
 +
* [[Team:Paris/Protocols_Culture#Competent bacteria | Competent bacteria]]
 +
**[[team:Paris/Protocols_Culture#CaCl2a|CaCl<sub>2</sub> (iGEM Paris2007)]]
 +
**[[team:Paris/Protocols_Culture#CaCl2b|CaCl<sub>2</sub> (2nd Protocol)]]
 +
**[[team:Paris/Protocols_Culture#RbCl|RbCl]]
 +
* [[team:Paris/Protocols_Culture#Glycerol stock|Glycerol stock]]
 +
*[[team:Paris/Protocols_Culture#Ferric citrate growth medium|Ferric citrate growth medium]]
-
<p>16: Quand on a fini :
+
===4. Molecular biology===
-
<p>Remonter l'objectif</p>
+
*[[Team:Paris/ProtocolsMB#PCR with Quick load Taq2x Master Mix|PCR]]
-
<p>Utiliser le joystick pour sortir la lame</p>
+
*[[Team:Paris/ProtocolsMB#PCR colonies|PCR colony]]
-
<p>Sur l'objectif passer un coup de papier kodak (à celle mise en contact avec l'huile)</p>
+
* Gels
-
<p>Pour Eteindre, il faut attendre 30 minute pour le premier switch (en partant de la gauche et eteindre de gauche à droite (inverse du sens d'allumage...) (sinon laisser allumer))</p>
+
* Digestion
 +
* Ligation

Latest revision as of 16:35, 20 October 2009

iGEM > Paris > Protocols > Main


Contents

Main

1. Microscopy

  • Protocols suggested
  • [http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp00282.pdf Protocol to membrane dying, DID method (pdf)]

2. Adapted Protocols

3. Culture protocols

4. Molecular biology

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