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Team:Paris/ProtocolsA
From 2009.igem.org
Protocols
Here you will find the collection of protocole we use, or just collect. And because we are well-known chauvinist it is just a tribute to previous Paris iGEM team . We try our best not to make it redondant.
B. Protocols suggested
Utilisation du microscope a fluo (à mettre en anglais et en plus beau)
I: CULTURE DES BACTERIES
A : Culture de bactérie (choisir des couleurs différents (GFP+YFP pas compatible car jaune et vert trop proche)
A (bis): Coloration de la membrane des bactéries avec du DID si on veut se référer au protocole.
II: PREPARATION DE LA LAME (au moins quelque heure à l'avance, ou le mieux c'est la veille: pour que la lame soit sèche, sinon les bactéries pataugent)
1: Nettoyer la lame de verre
2: On colle la fenêtre dessus (carré ou rectangle bleu)
3: Préparer le milieu s’il n'est encore fait : 1,5% Agarose+ le milieu (LB)
4: Faire chauffer en microonde le milieu préparé
5: 50 µL du milieu agarose, et le mettre au milieu du carré collé sur la lame.
6: Superposer une deuxième lame par dessus, sans faire de bulle en appuyant sur la bordure bleu du carré (et pas au milieu du carré (pendant 30 seconde)
7: Mettre au frigo 10 minutes
III: PREPARATION DES CELLULES À OBSERVER
1-Resuspendre les bactéries prélevées dans un ependorff dans 1 ml de son milieu (LB)
2-Vortexer pas trop sinon ça tue les cellules.
IV: PREPARATION DE LA LAME A OBSERVER
1: Ressortir la lame du frigo
2: Enlever la lame du dessus (en la glissant)
3: Couper l'agarose dépassant du carré
4: Découper en plusieurs morceaux l'agarose, si on veut faire plusieurs observations différentes en même temps.
5: Poser les cellules sur le gel d'agarose (environ 1 microlitre de la suspension cellulaire (pas de risque de débordement sur le gel))
6: Sécher la lame en agitant dans l'air
7: Poser une lamelle sur la lame (attention bulle poser la lame d’un côté et la laisser tomber)
V: OBSERVATION AU MICROSCOPE
1: Allumer l'ordinateur (s’il n’est pas allumé)
2: Allumer les 4 switchs sur les étagères (de droite à gauche !!!!)
3: Allumer sur la tranche du microscope le bouton vert
4: Allumer le climatiseur (module tout en haut, pour maintenir la cage à 37°) (s’il n’est pas allumer)
5: Lancer le logiciel MetaMorph
6: Placer la lame sous le microscope dans l'emplacement réservé
7: Manipuler le joystick pour mettre la lame en dessus de l'objectif
8: Si on utilise le x100, mettre une goutte d'huile sur la lame.
9: Mise au point:
_Choisir "Trans No Filter" (lumière blanche)</p>
10: Bouger la tirette pour avoir la vision caméra ou occulaire.
11: Sélectionner l’onglet Acquire->Acquire->More
12: Vérifier que la température de la caméra est à environ - 30°C (voyant vert quand tout se passe bien)
13: Show live (pour voir ce qui se passe en direct à la caméra
Si aucune image ne se forme (vérifier que la tirette est tiré en position "écran")
14: Setting Modified (pour régler le temps d'exposition)
Si " Trans No Filter" (au début): mettre "100 ms trans on"
Si on utilise un filtre (CFP, GFP, etc...):mettre "1s fluo at"
Mais si ce n’est pas encore très claire (le mettre "4s fluo at")
Attention: On n’a pas tout les filtres (en particulier GFP)
Si on veut utiliser le filtre RFP, il faut prendre le dernier et pas l'avant dernier
15: Cliquer sur Acquire pour prendre la photo ou sur Show live pour la vision direct de la caméra
16: Quand on a fini : <p>Remonter l'objectif
Utiliser le joystick pour sortir la lame
Sur l'objectif passer un coup de papier kodak (à celle mise en contact avec l'huile)
Pour Eteindre, il faut attendre 30 minute pour le premier switch (en partant de la gauche et eteindre de gauche à droite (inverse du sens d'allumage...) (sinon laisser allumer))
